高鹽飲食對小鼠認知功能的影響及其與腸道菌群的關系

雷超，劉聰，劉亭，劉志華

廣州醫科大學附屬第五醫院中心實驗室，廣州510700

隨著生活水平的提高，不良飲食習慣作為多種疾病發生的危險因素而逐漸受到關注，其中高鹽飲食被公認為是高血壓、心臟病等心腦血管疾病的危險因素。高鹽飲食指每日飲食中超過6 g 的鈉鹽攝入量，除食用鹽外還包括醬油、味精等調味品。近年來少數基礎研究提出，高鹽飲食還可能影響認知功能，但其具體作用機制尚不明確［1］。研究顯示，菌—腦軸在調控神經系統生理功能方面發揮重要作用［2］。臨床研究顯示，與健康人群相比，患有認知功能受損性疾病的患者，如阿爾茨海默病、精神分裂癥，常表現出特征性的腸道菌群結構改變。突觸素（SYP）是一種與突觸結構和功能密切相關的膜蛋白，是突觸發生和突觸可塑性的重要標志，而突觸丟失及功能異常與腦的高級功能，如學習記憶和認知功能受損等有關。2019 年 10 月－2020 年 5 月，本研究觀察了高鹽飲食對小鼠認知功能的影響，并探討其機制是否與腸道菌群紊亂有關。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF級雄性C57BL/6小鼠20只，5周齡，體質量約20 g，均購自廣東省醫學實驗動物中心；適應性喂養7 d，飼養期間動物房室溫維持（22±2）℃，保持每天12 h光照并進行通風。主要試劑：老鼠普通維持飼料（0.2% NaCl）和高鹽飼料（8% NaCl）均購自廣東省醫學實驗動物中心，RNA抽提、cDNA 合成試劑盒及PCR 反應體系均購自日本TaKaRa公司，PCR引物由廣州艾基生物技術有限公司設計合成。

1.2 動物分組及處理方法 將20 只SPF 級雄性C57BL/6 小鼠隨機分為正常飲食組和高鹽飲食組，每組10只。正常飲食組給予普通維持飼料喂養，高鹽飲食組給予高鹽飼料喂養，兩組均喂養16周。

1.3 小鼠認知功能觀察

1.3.1 偏愛率 采用新異物體識別實驗。實驗前3 d，每天依次將小鼠放入長、寬、高均為50 cm 的黑色塑料箱中，讓其在里面適應15 min 后取出。第4天正式實驗時，室溫保持25 ℃，用乙醇均勻噴灑箱壁后擦干以清除氣味；在距側壁15 cm 處平行放入兩個相同顏色和大小的長方體，在對側放入小鼠，讓其在箱內探索8 min 后取出；20 min 后，用乙醇噴灑箱壁后擦干，用圓柱體取代其中的一個長方體，放入小鼠讓其探索5 min，記錄小鼠探索兩個物體的總時間以及探索圓柱體的時間，探索時間為小鼠使用鼻子或嘴巴、前爪接觸或距離物體2～3 cm 的時間。偏愛率=探索圓柱體的時間/探索兩個物體的總時間×100%。

1.3.2 自發反應交替率 采用Y 迷宮實驗。本實驗使用的Y 迷宮有三臂，各臂夾角均為120 ℃，每一臂尺寸均為40 cm×10 cm×15 cm，在迷宮各個臂內貼上不同的幾何圖形，作為視覺標記。將小鼠放在一個臂的末端，記錄8 min 內小鼠進入各個臂的順序，并在結束時噴灑乙醇，充分消除殘留的氣味。自發性交替反應被定義為連續進入3 個臂，如1、2、3 或1、3、2。自發反應交替率=實際自發交替反應次數/（進臂總次數-2）×100%。

1.4 糞便腸道菌群差異性檢測 采用高通量測序法進行16S rDNA 基因V4 片段的基因測序。收集兩組小鼠的新鮮大便，將樣品（＞0.5 g）置于標準冷凍管中，立即置于液氮保存，樣本檢測由北京百邁客生物科技有限公司完成。首先對送檢DNA 樣品進行檢測，檢測合格后的樣品構建文庫；回收目的擴增片段，用 T4 DNA 聚合酶、Klenow DNA 聚合酶和 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK），將打斷形成的黏性末端修復成平末端，再通過3'端加堿基腺嘌呤（A），使得DNA 片段能與3'端帶有堿基胸腺嘧啶（T）的特殊接頭連接；或者設計合成含有測序接頭的雙索引序列融合引物，以基因組DNA 為模板進行PCR 反應，利用磁珠法篩選目的擴增片段，最后用合格的文庫進行DNA 簇（DNA cluster）制備和測序。采用Mothur（version v.1.30）軟件分析OUT 和α 多樣性；OTU 即分類操作單元，是在系統發生學研究或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系、種、屬、分組等）設置的同一標志，本研究采用序列之間的97%相似性把某一個分類單元定義為一個OTU，每個OTU對應于一種代表序列；α多樣性指標包括 Chao1、Ace、Shannon 和 Simpson。采用Metastats軟件比較兩組門水平和種水平上的菌群相對豐度。

1.5 腦組織SYP mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后處死，取出腦組織，用生理鹽水仔細清洗表面血跡。使用TRIzol 試劑盒提取腦組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，參照試劑盒說明書進行操作。PCR 反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，之后95 ℃持續40個循環，每個循環15 s，60 ℃ 1 min。引物序列：SYP上游引物 5′-TGGAGTGTGCCAACAAGACG-3′、下游引物5′-CAAACACAGCCACGGTGACAA-3′，內參β-actin 上游引物 5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′、下游引物 5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。所有反應設2 個復孔，實驗重復2 次。采用2-ΔΔCt法計算SYP mRNA相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS15.0 統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠認知功能相關指標比較 高鹽飲食組小鼠偏愛率、自發反應交替率分別為62.4% ±2.4%、57.2% ± 3.0%，正常飲食組分別為72.0% ±3.1%、69.1% ±2.3%，兩組比較P均＜0.05。

2.2 兩組小鼠糞便腸道菌群構成比較 高鹽飲食組小鼠糞便菌群OUT 為168.0 ± 11.7，正常飲食組為155.4 ± 12.7，兩組比較P＞0.05。高鹽飲食組小鼠糞便菌群 α 多樣性指標 Ace、Chao1、Shannon、Simpson 分 別 為 196.1 ± 7.3、179.1 ± 8.2、3.0 ±0.1、0.120 ± 0.010，正常飲食組分別為 181.2 ±9.9、174.5±9.3、3.1±0.2、0.100±0.007，兩組比較P均＞0.05。門水平：高鹽飲食組小鼠糞便菌群中厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）的相 對 豐 度 分 別 為 49.29% ± 12.73%、35.26% ±14.31%、6.42% ± 7.11%、0.45% ± 0.17%，正常飲食組分別為41.25% ± 13.20%、48.28% ± 8.73%、6.29% ± 4.47%、0.26% ± 0.19%，兩組比較P均＞0.05（OSID 碼圖1）。種水平：高鹽飲食組小鼠糞便菌群中嗜黏蛋白艾克曼菌（A.muciniphila）、產酸芽孢桿菌（B.acidifaciens）、柔嫩梭菌菌（C.leptum）、嚙齒動物糞桿菌（F. rodentium）相對豐度分別為7.024% ± 0.461%、0.243% ± 0.037%、0.047% ±0.028%、1.292% ± 0.145%，正常飲食組分別為2.113% ± 0.023%、0.033% ± 0.002%、0.213% ±0.048%、0.023%±0.003%，兩組比較P均＜0.05。

2.3 兩組小鼠腦組織SYP mRNA 相對表達量比較 高鹽飲食組與正常飲食組小鼠腦組織SYP mRNA相對表達量分別為0.811 2±0.039 0、1.000 0±0.054 6，兩組比較P＜0.05。

3 討論

認知功能是腦的重要功能之一，主要指學習與記憶能力。研究表明，認知功能障礙相關性疾病患者大多出現具有特征性的腸道菌群結構變化，說明腸道菌群與認知功能受損可能有關［3］。腸道菌群主要存在于結腸，種類估算有1千種以上，主要分為四大菌門：Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria，不同種類細菌的數量維持動態平衡，可作為整體參與食物消化吸收、維持腸上皮屏障功能、調節免疫等機體生理活動［4］。腸道菌群的結構、多樣性變化時，可不同程度地影響宿主的生理功能，或可導致病理改變。近年來腸道菌群與全身多系統相互作用的機制陸續被提出，如腸道菌群—腸—肝軸、腸道菌群—腸—肺軸以及本文研究的腸道菌群—腸—腦軸［5］。既往主流觀點強調中樞神經系統在腸道菌群—腸—腦軸調控中占主導地位，隨著菌群測序技術的成熟及糞菌移植方法的流行，越來越多的研究報道認為腸道菌群在調控中樞神經系統的發育和功能狀態方面存在不容忽視的作用。因此，本研究探討腸道菌群紊亂與不良飲食習慣誘導的認知功能損傷的相關性。

本課題組既往行為學結果顯示，普通小鼠認知功能存在個體間差異，為避免抽樣誤差，實驗應用隨機分組原則；其次兩組小鼠均選取相同的品系，并在相同的環境中飼養，避免遺傳、環境等因素對腸道菌群的影響。與之前的高鹽飲食研究［6］不同的是，我們并未在小鼠飲用水中添加一定濃度的鈉鹽，這能更好地模擬人類的不健康飲食習慣。Y 迷宮主要用于小鼠辨別性學習，工作記憶和參考記憶的測試；新異物體識別實驗可用于非空間記憶的測試。這兩種方法具有讓小鼠在自由活動狀態下進行學習記憶的特點，能充分反映小鼠的認知功能狀態。本研究結果顯示，高鹽飲食小鼠的自發反應交替率和偏愛率均明顯降低，說明高鹽飲食降低了小鼠的認知功能。此外，高鹽飲食小鼠腦組織SYP mRNA 相對表達量下降，而SYP在神經遞質釋放、突觸可塑性和突觸發育等重要生理過程中均發揮重要作用［7］。因此，高鹽飲食可能通過影響神經系統突觸相關生理過程而損傷小鼠的認知功能。

本研究采用OUT 和α 多樣性來評估腸道菌群多樣性的變化，α 多樣性有4 種衡量指標，分別為Chao1、Ace、Shannon 和 Simpson，結果顯示兩組OUT和α多樣性指標比較均無統計學差異。腸道菌群的構成主要由飲食和生活方式決定，遺傳因素的影響很小，由飲食習慣不同導致的腸道菌群多樣性變化主要表現為食物種類差異，而高鹽飲食未改變飲食中各種營養素的占比，對腸道菌群整體的生存、代謝方式影響較小，故本研究顯示高鹽飲食對腸道菌群多樣性的影響較小，同時暗示腸道菌群受到高鹽飲食的影響或許僅局限于少數有重要意義的菌種上。為了進一步探索腸道菌群構成的變化，我們首先分析了兩組腸道菌群構成在門水平的差異，結果顯示高鹽飲食組Firmicutes 相對豐度升高，而Bacteroidetes 相對豐度降低，但并無統計學差異。研究顯示，腸道菌群結構的這一變化不僅與肥胖、結腸炎、冠心病等疾病有關［8］，近年來也被發現與神經系統疾病如抑郁癥、精神分裂癥、自閉癥等有關［9］。在種水平上，我們進一步找出了四種差異細菌，分別為A.muciniphila、B.acidifaciens、C.leptum、F.rodentium。A.muciniphila 是2004 年在人體腸道中分離出來的菌種，在人類消化道中普遍存在，占比3%～5%，補充A. muciniphila 或可延緩衰老，增強抗腫瘤藥物療效［10］。B.acidifaciens 可促進結腸中分泌型 IgA 的產生，進而保護腸上皮黏膜［11］。這兩種菌群豐度的增加可能來源于長期高鹽飲食對腸道內環境的破壞而引起的代償性保護反應，這一獨特的發現有待未來深入研究。F. rodentium 與人類疾病相關的研究甚少。C.leptum 是一種產丁酸鹽菌，而丁酸鹽被發現可抑制帕金森病模型小鼠的神經細胞凋亡以及組蛋白乙酰化，從而改善認知功能；其次，丁酸作為短鏈脂肪酸之一，亦有助于抑制機體炎癥反應、調節免疫功能［12］。結合在門水平上Firmicutes 豐度增加及Bacteroidetes 豐度減少與機體促炎細胞因子的增多相關，而腦組織慢性微炎癥狀態與認知功能下降相關。因此，我們推測高鹽飲食可損傷小鼠的認知功能，可能主要與促炎相關的腸道菌群失調及少數幾種細菌相對豐度改變有關，尤其是與產丁酸鹽菌C.leptum 的減少相關，但其因果關系驗證尚需糞菌移植等菌群干預措施進一步驗證。

綜上所述，高鹽飲食可損傷小鼠的認知功能，其機制可能與腸道菌群紊亂有關。雖然許多關于腸道菌群—腸—腦軸參與飲食模式調控疾病發生發展相關的研究均強調腸道菌群應作為一個整體發揮效應，但本研究認為高鹽飲食對腸道菌群的影響應著重于驗證少數受到影響的細菌，高鹽飲食與C.leptum 減少的相關性有待在更大樣本量的基礎實驗及臨床試驗中進行驗證，以及C.leptum 是否是高鹽飲食損傷認知功能的關鍵介質仍有待確定。