酶聯免疫吸附試驗操作要點

陳華

（江蘇省揚州市邗江區西湖鎮畜牧獸醫站，江蘇 揚州 225200）

1 樣品運輸與保存

1.1 樣品運輸 ELISA（酶聯免疫吸附試驗）的樣品一般為全血或血清。運輸溫度偏高、運輸時間過長的血樣會導致ELISA 靈敏度偏低，因此夏季血樣應低溫運輸。

1.2 樣品保存 如48h內能完成檢測，血樣只需2～8 ℃冷藏即可，如48 h 內無法完成檢測，血樣應于-20 ℃保存，長期保存血清可在-80 ℃，全血樣品不適合凍存。血液樣品含水量較大，冷凍固定時會對血樣結構造成破壞，故超低溫快速冷凍固定多適用于組織而非血樣。

2 樣品稀釋

ELISA 一般要求對血樣進稀釋，不按要求稀釋會出現非特異性反應，即假陽性。取出血樣后，若發現膠凍樣樣品和溶血樣品，應盡量棄去。研究表明重度溶血樣品可能導致ELISA 出現假陽性。

稀釋過程中影響實驗結果的有兩項：一是實驗器材，微量移液器的精準度和吸頭的質量會對實驗結果造成較大影響，劣質的吸頭會導致更多的樣品掛壁殘留，造成稀釋倍數不準確；二是稀釋方法，稀釋樣品應當混勻，稀釋時應當避免取樣過少，一般用10 μL稀釋比用1 μL稀釋更準確，更能避免樣品掛壁影響。如果稀釋倍數過大，可采用梯度稀釋的方法稀釋，如稀釋40 倍，可以先進行4 倍稀釋，再進行10 倍稀釋，以保證稀釋的精確度。

3 試劑盒平衡

實驗前將試劑盒從2～8 ℃冷藏室取出置室溫下，使試劑盒及板條恢復至室溫（一般要求為20～25 ℃），平衡時間至少20 min。冬季室溫偏低，平衡耗時加長，可將試劑盒置于暖風下或37 ℃溫箱內。未平衡狀態下進行實驗會導致孵育不充分，影響樣品與包被物的特異性反應。

4 加樣方法

ELISA易出現污染的步驟就是加樣。加樣必須使用一次性的潔凈吸頭，每吸取一個樣品都須更換吸頭。

加樣時應避免沿管壁加樣，以免造成非特異性吸附，影響加樣準確性；應當避免加樣過快，以免造成液體濺出，出現交叉污染；應當避免產生氣泡，特別是讀取吸光值時，氣泡會對最終結果產生影響。

正確的加樣方法是勻速輕緩地將樣品加于酶標板孔底，且加樣時間不宜過長，否則會導致第一孔與最后一孔反應時間差異過大，影響實驗結果。如果樣品數量過多，加樣時間過長，可使用排槍。

5 孵育方法

孵育是液相的抗原或抗體和酶標板反應孔內固相的抗原或抗體發生特異性反應的過程，這一步驟要求一定的反應溫度和反應時間。常見的孵育溫度為37 ℃和室溫，一些ELISA 要求43 ℃、2～8 ℃和其他溫度。如果孵育溫度為37 ℃，則可使用溫箱孵育，注意孵育前使溫箱溫度達到37 ℃，因為孵育所需時間與孵育溫度成反比，所以未達到要求溫度進行孵育會使抗原抗體反應不充分。

除此之外，孵育被證明會受到“邊緣效應”的影響。用相同的樣品在96孔板進行ELISA測定，會出現外周孔和中心孔吸光值不同的現象。這是由于酶標板材料——聚苯乙烯為不良導體，在從室溫加熱到37 ℃的過程中，外周孔和中心孔之間存在一定的熱力學梯度，從而使酶標板的溫度在剛放進溫箱時并不均一。因此孵育前可用水浴或其他方法均勻加熱，去除“邊緣效應”的影響。為防止反應液的蒸發和污染，孵育過程中酶標板須貼上板貼。

6 洗板方法

6.1 洗滌液配制 洗板是ELISA 必不可少的步驟。在孵育過程中，除發生抗原抗體特異性結合反應外，還會出現非特異性吸附，因此，必須通過洗板將非特異性吸附物質洗去，避免實驗結果出現假陽性。

洗板一般需要稀釋洗滌液。稀釋前注意觀察濃縮洗滌液是否有結晶，如果有結晶則先讓結晶在室溫下全部溶解再進行稀釋。稀釋必須使用新鮮的蒸餾水，按說明書的稀釋倍數進行稀釋。

6.2 注意事項

6.2.1 加洗滌液時，沖擊力不可過大，且洗滌液盡量不要溢出孔外，一般每孔加300 μL即可。

6.2.2 加入洗液后，需要靜置1～3 min，以提高洗板的效率，避免非特異性物質殘留。

6.2.3 兩次洗滌之間和加入酶標抗體之前，應避免包被孔干燥。酶結合物不耐干燥，且高溫下容易失活，包被孔干燥時間越長，最終得到的吸光值越低。

6.2.4 拍板時可在吸水紙下墊一層泡沫板，防止抗原抗體復合物脫離。拍板要垂直，避免交叉污染，每次拍板要盡量拍干。每次拍板后都要更換一次性吸水紙，尤其是拍過酶標記物的吸水紙。吸水紙應選擇不易脫屑且吸水性強的。

6.2.5 洗板次數一般為3～5次，次數低于3次易出現假陽性，高于5次易出現假陰性。

6.2.6 為避免人工洗板造成的不確定性，可采用自動洗板機洗板，使用洗板機要檢查沖洗頭是否順暢。由于自動洗板機洗板后不能完全拍干，有較多液體殘留，故可適當增加洗板次數或采用機洗和人工洗板相結合的辦法減少誤差，即機洗后人工洗板1～2次。

7 底物添加

目前ELISA 廣泛使用的標記酶是辣根過氧化物酶（HRP），其一般以鄰苯二胺（OPD）和3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（TMB）為底物。OPD 和TMB都有毒性和致突變性，操作過程中要注意防護。

加入底物前，要先檢查底物的有效性，如果以TMB 為底物，一般會提供A、B 兩瓶底物試劑，可各取少量相同體積的A、B 試劑于潔凈的反應孔或試管內，觀察是否出現顯色反應，如果以OPD為底物，則應呈無色。在加入底物及之后的孵育過程中要注意避光，特別是OPD，這種底物在光照條件下會分解顯色，影響結果的準確性。平常保存底物也應注意避光。

8 顯色方法

顯色最重要的是時間的把握，應按照ELISA說明書上標明的底物反應時間操作，到時間后立即加入終止液，終止液的加入順序要和底物溶液的加入順序相同。加入終止液后可觀察到淡藍色溶液變為黃色。

9 比色方法

加完終止液后立即進行比色，否則非特異性顯色會隨之增加。

比色可通過肉眼觀察顏色梯度，但要精確得出結果還應使用酶標儀。測量前酶標儀應預熱15～30 min，使光源穩定。不同的ELISA 試劑盒要求不同的濾鏡，不同的波長。TMB底物的顯色波長為450 nm，OPD的顯色波長為492 nm。除使用單波長比色，也可使用雙波長比色減小誤差，即在敏感波長和非敏感波長各測一次，非敏感波長一般設為630 nm 或650 nm。由于實際測量的吸光值是溶液的吸光值、酶標板本身的吸光值及灰塵、指紋等污垢的吸光值之和，所以可用非敏感波長減少非樣本的影響。