鹽炙杜仲對維甲酸誘導的骨質疏松大鼠骨生長因子及骨代謝的影響

熊 偉，趙 亮

(1.武漢市第一醫院(武漢市中西醫結合醫院)，湖北 武漢430022；2.武漢市中醫醫院，湖北 武漢430014)

骨質疏松(Osteoporosis，OP)是一種骨代謝性疾病，以骨微量結構損傷、骨量、骨密度損失為主要特征，多發于老年人。隨著我國人口老齡化日益嚴重，OP發病率隨之上升，據預測，2020年我國將有近3億OP患者，約占世界的50%以上[1]。OP極易引發骨質疏松性骨折(Osteoporotic fracture，OPF)，嚴重影響生活質量。

杜仲為傳統中藥，歷史悠久，其主要功效為補腎陽、納氣、強筋骨，多用于肝腎不足、腰膝酸痛[2]。杜仲中含有的總黃酮可促進骨細胞合成Ⅰ型膠原蛋白，可以有效改善OP患者癥狀。一定濃度的杜仲提取物能夠促進骨細胞因子生長、抑制相關炎性因子的表達，達到防治OP的目的[3]。目前，西醫治療OP多使用骨吸收抑制劑、骨形成促進劑、骨礦化物三大類，療效有一定的局限性，且存在藥物不良反應，因此，亟需尋求更有效且副作用小的治療方案。為此，本實驗通過建立維甲酸誘導的OP大鼠模型，觀察骨密度、骨生長因子及相關細胞因子，探究鹽炙杜仲治療OP的療效，明確其抗骨質疏松作用，為臨床新藥應用提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠60只(200±10 g/只)，3月齡，購于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心(合格證號：SCXK(鄂)2016-0005)，飼養環境為SD大鼠飼養SPF級屏障環境。

1.2 實驗藥物

鹽炙杜仲提取物(武漢市中醫醫院藥學基地提供，按照高、中、低劑量組給藥，生藥量分別換算為6、3、1.5 g·kg-1)；骨疏康顆粒(遼寧康辰藥業有限公司購得，批號：國藥準字Z20003255)；維甲酸(陜西森弗生物技術有限公司，純度99.12%，批號081210)加純水配制成混懸液使用；0.5%CMC-Na(武漢谷歌生物有限公司)。

1.3 試劑及儀器

Prodigy型骨密度儀(GE，美國)；ELISA試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)；ADVIA2400全自動生化分析儀(西門子醫學診斷產品(上海)有限公司)；電子天平HZT型(北京實驗儀器生產有限公司)；骨鈣素試劑盒(武漢英顥科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

將60只SPF級雄性SD大鼠適應性飼養1周后，觀察其身體狀態，按體質量隨機分為六組：空白組、模型組、陽性對照組[骨疏康顆粒(5 g(生藥)/kg)]及杜仲高、中、低劑量組(6、3、1.5 g/kg；生藥)。空白組予以0.5%CMC-Na溶液，其他各組每日相同時段灌胃100 mg /kg維甲酸，連續14 d，建立大鼠骨質疏松模型[4]。

2.2 給藥方法

確定造模成功后，各組給予大鼠相應藥物灌胃，1次/d，共4周。杜仲高劑量組給予6 g/kg劑量溶液灌胃；杜仲中劑量組給予3 g/kg劑量溶液灌胃；杜仲低劑量組給予1.5 g/kg劑量溶液灌胃；空白組和模型對照組給予等體積0.5% CMC-Na溶液灌胃。每周測量大鼠體質量，以調整劑量。每日給藥體積1 mL/100 g。

2.3 指標檢測

2.3.1 骨密度檢測 將大鼠麻醉后置于DEXA探頭下，固定四肢，脊椎呈中立位，采用雙能X射線密度儀對大鼠股骨骨痂BMD和BMC進行檢測。

2.3.2 血清生化指標檢測 藥物干預結束后，各組大鼠禁食24 h，次日每只大鼠按3.5 mL/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉。取血清：經心臟穿刺采血，以4 000 r/min，4 ℃離心10 min，分離血清，收集上層血清，低溫保存。按ELISA試劑盒說明書上的步驟檢測分析血清TNF-α、IL-6、E2、BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠骨痂BMD、BMC比較

與空白組相比，模型組大鼠股骨骨痂BMD、BMC數值顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，杜仲中、高劑量大鼠股骨骨痂BMD、BMC數值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，無明顯差異(P>0.05)，說明杜仲中、高劑量組和陽性對照組療效相當。見表1。

表1 各組大鼠股骨BMD、BMC比較

3.2 各組大鼠骨生長因子比較

與空白組相比，模型組大鼠血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，杜仲中、高劑量大鼠血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平比較 ((x±s，μg·L-1)

3.3 各組大鼠激素及細胞因子水平比較

與空白組相比，模型組大鼠血清E2水平顯著降低(P<0.05)，TNF-α及IL-6水平有所升高(P<0.05)；與模型組相比，杜仲中、高劑量大鼠血清TNF-α及IL-6水平顯著降低，E2水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組血清E2、TNF-α及IL-6水平比較

4 討論

OP屬于祖國醫學“骨痿”范疇，基本病機為年老體衰、腎精虧虛，中醫認為其治則當是溫補腎陽、填精生髓兼以益氣養血。杜仲味甘、微辛，性溫，歸肝、腎經，具有“補肝腎、強腰膝、堅筋骨”的功效。近年來，通過動物實驗發現鹽灸杜仲有很好的補腎健骨作用，本實驗通過觀察大鼠骨生長因子、激素及細胞因子水平變化情況探討鹽灸杜仲防治骨質疏松的作用機理，為中醫藥臨床治療骨質疏松提供理論基礎。

骨密度被WHO推薦為診斷OP的金標準[5]，在一定程度上能反映骨礦物含量。本實驗結果顯示，模型組BMD、BMC水平較空白組明顯降低(P<0.05)，杜仲中、高劑量組大鼠股骨骨痂BMD、BMC較模型組也有顯著升高，與陽性對照組無明顯差異，這一結果進一步證實了鹽炙杜仲能有效提高骨質量，改善全身骨密度，對維甲酸誘導的骨質疏松癥有不錯的療效。

骨形態發生蛋白(BMP)轉化生長因子(TGF-β)中的一組多功能細胞因子，能誘導間質細胞增殖分化成軟骨細胞，為骨折愈合的關鍵性細胞因子之一。BMP-2在此過程中作用顯著，加速間質細胞轉化成軟骨細胞。IGF-1參與成骨細胞生長、分化及代謝調節過程，能有效促進骨細胞生成、刺激膠原合成從而促進骨基質形成[6]。血管內皮生長因子(VEGF)能夠促進骨組織內血管網生成，直接作用于成骨細胞，增加骨細胞ALP活性，刺激成骨細胞分化、改善骨組織內血供從而促進骨形成。本研究結果顯示，治療后，與模型組相比，杜仲中、高劑量組大鼠血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平明顯升高(P<0.05)，與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)。這說明在鹽炙杜仲作用下，通過提高骨生長因子水平促進血管內皮生長，能有效防止骨質疏松。

在骨代謝過程中，少不了雌激素的參與，它是保持骨質量與骨結構正常的必需激素，能影響成骨及破骨細胞活性、維持骨代謝平衡。有研究[7]表明，IL-6具有來源廣及作用途徑多的特點，主要通過調節破骨及成骨細胞來參與骨代謝過程，從而提高骨密度。TNF-α是重要的破骨細胞調節因子，通過炎癥反應誘導骨分解作用，還可通過促進骨細胞凋亡，從而達到抗骨質疏松的作用。IL-6、TNF-α的產生會促進骨吸收、加重病情發展。本實驗結果顯示，經治療后，杜仲中、高劑量組E2水平顯著升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α水平顯著降低到正常值(P<0.05)，提示杜仲能通過促進雌激素分泌及降低炎癥細胞因子水平對骨質疏松大鼠模型產生治療效果。

綜上所述，本實驗表明，中、高劑量的鹽灸杜仲能促進骨生長因子生成、影響炎癥細胞水平，達到治療骨質疏松的目的，具有可行性。