麩炒白術配方顆粒HPLC指紋圖譜研究

姚 娜，黃燕明，汪 靜，李雪銀，陳桂生，王 斌，康志英，3

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤山中藥資源開發有限公司，寧夏 固原 756300；3.廣東香雪南藥發展有限公司，廣東 肇慶 526642)

麩炒白術為白術飲片經蜜炙麩皮炮制加工制成。白術為菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，冬季下部葉枯黃、上部葉變脆時采挖，除去泥沙，烘干或曬干，再除去須根，即得。白術具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，臨床上多用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安的治療[1-2]。白術經麩炒后，健脾消食作用得以增強[3]。目前，麩炒白術藥理活性的研究主要圍繞抗衰老、調節免疫、利尿、調節腸胃功能以及抑制腫瘤細胞等方面展開[4]。麩炒白術主要含有揮發油、白術多糖、內酯類、氨基酸、微量元素和蒲公英萜醇乙酸酯等成分，其中揮發油、白術多糖和內酯類是麩炒白術的主要有效成分[5-8]。雖然已有文獻[9]對麩炒白術配方顆粒的特征圖譜進行研究并確定了8個特征峰，但是未對其特征峰進行指認。因此，本文采用HPLC法建立了麩炒白術指紋圖譜，確立了12個共有峰，并采用液質聯用技術(LC-MS)對8個共有峰進行指認，從整體上評價其工藝和質量，以提高麩炒白術配方顆粒的質量評價水平。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290型超高效液相色譜(UPLC)，連接6530型四級桿-飛行時間串聯質譜儀(Q-TOF-MS)，配有兩個獨立二元泵、可控溫自動進樣器、可控溫柱溫箱、二極管陣列檢測器(DAD)和電噴霧離子源(ESI)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS204TS萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler toledo公司)；KQ500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

白術對照藥材(批號：120925-201611)，購自中國食品藥品檢定研究院；咖啡酸(批號：110885-200102)，購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸A(批號：151028)、異綠原酸B(批號：150327)、異綠原酸C(批號：150724)均購自成都普菲德生物技術有限公司；乙腈(天津賽孚瑞公司，色譜級)；甲酸(天津市光復精細化工廠，分析純)；甲醇(北京化工廠，分析純)；乙酸乙酯(北京化工廠，分析純)；水為娃哈哈純凈水。

1.3 樣品

共收集18批白術飲片，其中安徽亳州6批，浙江東陽3批，浙江磐安2批，河北安國3批，湖南龍山2批，河南溫縣2批。樣品經廣州市香雪制藥股份有限公司高級工程師康志英鑒定為真品。參照2015年版《中國藥典》麩炒白術炮制方法將18批白術飲片炮制成麩炒白術飲片，由本實驗室根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》，研究麩炒白術配方顆粒的制備工藝，并按照確定的制備工藝制成18批中試批量的麩炒白術配方顆粒。

2 方法與結果

2.1 麩炒白術配方顆粒指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Waters Symmetry?-C18色譜柱(柱長為250 cm，柱內徑為4.6 mm，粒徑為5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.5%甲酸水溶液為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為313 nm，洗脫條件見表1。

2.1.2 參照物溶液制備 取白術對照藥材約1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加水25 mL，煎煮30 min，放冷，濾過，用乙酸乙酯萃取4次，每次25 mL，收集乙酸乙酯部分，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至5 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

表1 梯度洗脫條件

2.1.3 供試品溶液制備 取本品約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加水25 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)使溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次25 mL，收集乙酸乙酯部分，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至5 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 指紋圖譜方法學考察

2.2.1 專屬性試驗 取麩炒白術配方顆粒，按照“2.1.3”項下供試品溶液的方法制備，按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，結果12個共有色譜峰均不受溶劑因素干擾，專屬性良好。

2.2.2 精密度試驗 取上述麩炒白術配方顆粒樣品，按色譜條件測定，連續進樣6次，每次10 μL，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.1版)》進行評價，相似度均大于0.90，表明該儀器的精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 取同一批麩炒白術配方顆粒樣品，平行6份，按照“2.1.3”項下供試品溶液的方法制備，依法測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.1版)》進行評價，相似度均大于0.90，表明該分析方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，按色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h進樣分析，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.1版)》進行評價，相似度均大于0.90，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.3 指紋圖譜的構建

取18批麩炒白術配方顆粒，按供試品溶液制備方法和色譜條件測定，得到18批麩炒白術配方顆粒的色譜疊加圖(見圖1)。根據相對保留時間穩定及各批次樣品均能檢出的原則，選擇了12個特征峰作為共有峰。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.1版)》進行評價，結果相似度均大于0.90。

2.4 共有峰的指認

通過質譜檢測對麩炒白術配方顆粒指紋圖譜中的共有峰進行指認。

2.4.1 供試品溶液制備 同“2.1.3”項下方法制備供試品溶液。

2.4.2 色譜條件 色譜分離采用Agilent Eclipse Plus C18UPLC色譜柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)，配有在線過濾器。柱溫：40 ℃，流速：0.5 mL/min，流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～3 min (5% B)，3～5 min (5%～10% B)，5～10 min (10%～15% B)，10～13 min (15%～24% B)，13～17 min (24%～30% B)，17～20 min (30%～35% B)，20～23 min (35%～41% B)，23～27 min (41% B)，27～28 min (41%～100% B)，28～32 min (100% B)，后運行時間10 min。檢測波長：313 nm，每次進樣：3 μL。

圖1 18批麩炒白術配方顆粒HPLC疊加

2.4.3 質譜條件 分別在正、負離子模式下進行，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速6 L/min，霧化氣壓力45 psi，毛細管電壓3 500 V(正模式)和3 000 V(負模式)，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min。一級質譜質量掃描范圍50～1 100m/z。二級質譜選用Target-MS/MS模式，碰撞電壓10和30 eV。所得LC-MS數據由Agilent MassHunter軟件采集。

2.4.4 質譜分析 精密吸取麩炒白術配方顆粒供試品溶液注入LC-MS儀，按上述條件進行檢測，根據麩炒白術配方顆粒供試液的UPLC-UV色譜圖和UPLC-TOF-MS總離子流圖(正、負模式)，圖中標識的1～16號色譜峰物質，均得到了良好的分離和檢測(見圖2)。

通過高分辨TOF-MS的精確質量數測定，對上圖中1-16號峰物質進行了鑒定，結合在正模式下生成[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+等加合離子，和負模式下生成 [M-H]-加合離子的情況，推斷出化合物的精確分子量和分子式，結果見表2。

表2 麩炒白術配方顆粒UPLC-Q-TOF-MS分析

續表2

通過質譜檢測結果結合參考文獻比對分析，共推斷出13個色譜峰的化學結構。由于液質聯用儀的液相部分為UPLC，其色譜圖與HPLC的色譜行為有些差異。通過對照品比對4個已知成分咖啡酸、異綠原酸A、B、C，分析結果與質譜結果一致。12個HPLC共有峰中指認了其中8個已知成分。質譜分析結果與共有峰指認結果對應關系見表3。

2.4.4 對照圖譜的建立 取18批麩炒白術配方顆粒，按供試品溶液制備方法和色譜條件測定，通過質譜檢測和對照品比對，生成的對照指紋圖譜見圖3。

表3 質譜分析結果與共有峰指認結果對應關系

峰1：對羥基苯甲酸；峰2：咖啡酸；峰5：東莨菪內酯；峰6：異綠原酸B ；峰7：異綠原酸A ；峰8：異綠原酸C ；峰9：刺五加酮；峰10：洋薊素

3 討論

采用光電二極管陣列檢測器考察麩炒白術配方顆粒供試品溶液在不同波長下色譜圖情況。供試品溶液在190～400 nm波長下進行掃描，通過3D視圖和等吸收圖譜進行分析，結果顯示在250～330 nm波長范圍內，基線平穩，信息量較大。選取其中常見波長進行分析，313 nm下各色譜峰響應值適中，分離度良好，故最終確定以313 nm為檢測波長。

供試品提取溶媒考察對比了水提取與乙酸乙酯萃取的效果。結果發現，經乙酸乙酯萃取富集后，色譜圖中信息量較大，故采用乙酸乙酯萃取的方法制備樣品。

考慮到指紋圖譜多成分、整體質量控制，選擇白術對照藥材作為隨行對照，為與顆粒提取工藝保持基本一致，將白術對照藥材進行水煎煮。結果對照藥材與顆粒色譜峰基本一致，故選擇白術對照藥材作為麩炒白術配方顆粒指紋圖譜的參照物。

經與對照品比對，在25.585 min的色譜峰為咖啡酸的色譜峰，在44.497 min的色譜峰為異綠原酸B的色譜峰，在45.128 min的色譜峰為異綠原酸A的色譜峰，在46.935 min的色譜峰為異綠原酸C色譜峰，其中峰9響應穩定，達到基線分離，故選擇峰9作為對照品參照峰，并將其標記為峰S。

本文采用HPLC建立了麩炒白術配方顆粒指紋圖譜，對其相似度進行評估，采用UPLC-Q-TOF-MS分析技術指認了8個共有峰，分別為對羥基苯甲酸、咖啡酸、東莨菪內酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、刺五加酮、洋薊素，可為麩炒白術配方顆粒的大批量生產質量標準建立及全過程質量監控提供參考。