藥品霉菌和酵母菌總數能力驗證結果分析

王芬

摘要：目的：分析藥品霉菌和酵母菌總數的能力驗證的結果。方法：依據能力驗證作業指導書，及《中國藥典》2015年版四部通則1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法進行檢測，并采用雙人獨立操作，多廠家培養基。結果：樣品|Z|值均<1，均取得滿意結果。結論：分析藥品霉菌和酵母菌總數能力驗證結果，吸取經驗，不斷提高本實驗室藥品霉菌和酵母菌的檢測能力。

關鍵詞：藥品霉菌和酵母菌總數;能力驗證

【中圖分類號】 R453? ? 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）17--02

生活中霉菌無處不在，它會使食品藥品保質期變短、引起食品藥品霉壞變質。食用霉菌超標的食品藥品，如果產生一定量的霉菌毒素，可能引起急性中毒、慢性中毒。酵母雖然本身并非有害菌，但酵母超標會引起食物藥物變質，促進細菌的生長，引發各種腸道疾病，食用酵母超標的食物藥物可能引起腹瀉，危害身體健康。

霉菌和酵母菌總數是《中國藥典》2015年版四部通則1105非無菌產品微生物限度檢查的項目，是評價藥品安全性的重要指標【1】，參加此項目的能力驗證，從能力驗證的結果評價中得出有關自身能力的結論，通過能力驗證得到鍛煉，積累經驗，更好地開展日常檢驗檢測工作。

1材料和方法

1.1樣品來源

樣品由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供，樣品編號為20-R062，20-M648。

1.2培養及試劑

沙氏葡萄糖瓊脂SDA對照培養基購自中檢院，沙氏葡萄糖瓊脂SDA（含氯霉素）購自北京三藥，沙氏葡萄糖瓊脂SDA購自廣東環凱和北京三藥。

1.3實驗方法

1.3.1樣品處理：按作業指導書要求對樣品進行水化溶解處理，稀釋10-1到10-2兩個稀釋度，? 依據《中國藥典》2015年版四部通則1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法，進行后續檢驗，23.0℃，培養5天。

1.3.2具體步驟：每個項目由2名實驗員獨立完成（樣品水化除外）：人員1和人員2，選擇三個廠家培養基，環凱，三藥，中檢院，還增加三藥的含氯霉素的SDA。

2結果與分析

2.1不同廠家的SDA，檢驗人員1和檢驗人員2的檢驗結果偏差不大，|Z|都小于1，與理論值比較接近。

2.2用日常藥品微生物限度檢驗的思維，考慮樣品微生物限度的限值，未考慮到能力驗證樣品是人工污染樣品，樣品菌量不一定在微生物限值內，有可能更高，本次實驗只做10-1到10-2，存在取不到最適稀釋級的風險。

2.3霉菌和酵母菌的檢測過程要注意防止交叉污染的發生。霉菌和酵母菌數量偏低或偏高，涉及檢測過程中的各個環節，如稀釋度的選擇、稀釋過程刻度吸管的更換、傾注平板時培養基溫度、加入樣品并倒入培養基的時間是否控制在15min，培養基的質量控制等，需要實驗室對檢測過程中的各個環節加強質量控制。

2.4注意每天都觀察培養結果。霉菌和酵母菌計數中霉菌48小時，已經可以看見，72小時，已經長滿，如有細菌干擾，蔓延，就不好計數，所以霉菌和酵母菌應該24-48小時開始計數。并繼續觀察到5天。培養期間的觀察時不能觸碰平皿，避免孢子脫落生長，影響計數結果。

霉菌在平板上生長的菌落較大，較難辨別每個單個菌落，因此在計數時應更為仔細認真辨別。 如果霉菌酵母菌都長，酵母菌在皿底觀察，更容易計數。

2.5實驗關鍵步驟可以拍攝照片，可在實驗過程中發現不滿意結果時，較好的根據實際情況進行溯源分析【2】。像此次能力驗證，未考慮酵母菌，直接把霉菌形態外的菌落認定為細菌，單計數霉菌菌落數，如果及時拍照，可重新計數，待后續鑒定細菌和酵母菌后，確定最終結果，避免錯報。

2.6能力驗證樣品是人工污染樣品，是定向計數，霉菌和酵母菌總數就不考慮把細菌算進去。B20200004（20-M648）樣品，看菌落形態，只判斷有細菌，霉菌，未對細菌進行相關鑒定，未考慮到酵母菌的可能，直接按霉菌的形態判斷為霉菌，以霉菌來計數，按霉菌結果報送，存在可能漏掉酵母菌的風險。

能力驗證樣品發樣前，應該用質控菌做相關實驗，熟悉常見細菌，霉菌，酵母菌在TSA、SDA等培養基上的形態。學會鑒定區分酵母菌和細菌。酵母菌容易與細菌混淆，要做相應的實驗，鑒定是酵母菌還是細菌，避免漏掉酵母菌。

2.7本次實驗是檢驗開始后，才考慮用含氯霉素的沙氏葡萄糖瓊脂，含氯霉素的沙氏葡萄糖瓊脂的結果是水化樣品48h后的，存在樣品含菌量減少的風險。所以實驗前應該提前考慮好，實驗可能存在的干擾因素，參考食品檢驗方法，選擇多種選擇性培養基進行實驗，比如含氯霉素SDA，玫瑰紅鈉、孟加拉紅、PDA，或者霉菌和酵母菌測試紙片進行輔助判斷。

3.細菌、霉菌和酵母菌的區別

SDA培養基中葡萄糖占62%，高糖高滲的環境對細菌有一定的抑制能力，但并不能完全抑制細菌的生長。2015年版藥典微生物計數法明確了SDA培養基中細菌能夠生長這一客觀事實。【3】當細菌造成霉菌和酵母菌總數結果不符合規定時，明確可采用含抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂培養基或其他選擇性培養基進行霉菌和酵母菌總數測定。【4】

孟加拉紅培養基常用于食品的霉菌和酵母菌計數 ，其組分與沙氏葡萄糖瓊脂培養基比較，除了緩沖劑、微量元素、凝固劑和供微生物生長必須的碳源、氮源及能源，其中每 1 L 還含有 0.1 g 氯霉素和 0.033 g 孟加拉紅。氯霉素為廣譜抗生素，可以抑制細菌的生長;孟加拉紅為選擇性抑菌劑，其不但可以抑制細菌生長，還能減緩霉菌因生長過快導致的菌落蔓延。而沙氏葡萄糖瓊脂培養基沒有選擇性，細菌同樣可以生長，如果大量細菌、霉菌和酵母菌同時在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長，則無法排除細菌干擾，導致霉菌和酵母菌計數不準確。【5】

但是由于一些難以預計的因素，例如培養基的質量等。在孟加拉紅培基上也可能生長出細菌菌落來，有時候未凸出瓊脂表面的霉菌菌落也不太好判斷。以下為一些區分孟加拉紅培基上細菌、霉菌、酵母菌的方法：

3.1觀察菌落特征

通常情況下三種菌落在孟加拉紅培基上的特征比較：

3.2低倍鏡觀察菌落邊緣形態：

若是肉眼觀察菌落形態還無法判斷的話可以用普通光學顯微鏡觀察菌落的邊緣較薄較透光的部分。觀察是否具有可以辨別的特征性結構。

3.3染色法

挑取菌落用亞甲基藍或革蘭氏染色，酵母菌或霉菌在低倍鏡下即可見到孢子或菌絲，而細菌不可見。

4.結論：藥品霉菌和酵母菌總數測定，除了考慮定量檢測的關鍵因素，如稀釋度的選擇、稀釋過程刻度吸管的更換、傾注平板時培養基溫度、加入樣品并倒入培養基的時間控制在15min，培養基的質量控制等，還要注意區分細菌和酵母菌，鑒定酵母菌，整體提高霉菌和酵母菌的檢測能力。

參考文獻：

[1]呂婷婷，吳嬌嬌 板藍根顆粒霉菌和酵母菌總數不確定度評定? 中國藥物評價 2019年第 36卷第 4期 278-280

[2]徐靜姿 浙江省檢測實驗室阪崎桿菌和金黃色葡萄球菌檢測能力驗證情況分析 中國衛生檢驗雜志 2015年6月第25卷第12期 2052-2053

[3]國家藥典委員會 中國藥典分析檢測技術指南? 2017年7月第1版編著569

[4]國家藥典委員會 中華人民共和國藥典 2015 年版.四部[S].2015：144

[5]石琳，杜蓉，李學興 藥品霉菌和酵母菌計數替代培養基驗證 藥物分析雜志2019，39（5）? 859-863