SFRP1 和DNMT3a 及DNMT3b 蛋白檢測在結直腸癌中的意義及相關性分析

李艷芳 王燕（通訊作者） 石明雋

（1 貴州省腫瘤醫院 貴州 貴陽 550001）

（2 貴州醫科大學病理生理教研室 貴州 貴陽 550025）

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是全球臨床常見惡性腫瘤之一，據統計發現，近10 年來結直腸癌在中國的發病率和病死率呈逐年上升趨勢[1]。結直腸癌的發生涉及到多種癌基因的激活和抑癌基因的失活；Wnt 信號通路的異常活化與腫瘤形成密切相關，其中分泌型卷曲蛋白受體相關蛋白1(secreted frizzled-related proteins family，SFRP1)作為Wnt 信號通路的抑制因子,被證實是一種抑癌基因。

抑癌基因表達沉默是腫瘤發生的一個重要的發病機制，而DNA 甲基化是抑癌基因表達沉默的重要途徑之一。研究顯示，SFRP1 異常甲基化普遍存在結直腸癌中，而SFRP1 甲基化可能是導致其表達下降或沉默的主要原因之一[2-3]。DNA 甲基化主要通過DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase DNMTs）的催化和維持。真核生物中已明確的DNMTs 包括三個活動形式，即DNMT1，DNMT3a 和DNMT3b，其中DNMT3a 和DNMT3b 能在不需要模板鏈的指導下使未發生甲基化的DNA 雙鏈上進行甲基化修飾[4]。近年來研究發現[5-7]，DNMT3a和DNMT3b過表達可能參與了結腸癌的發生、發展。國外部分學者進一步對SFRP1 與DNMTs 之間可能存在的關系進行了研究[8-9]，推測DNMT3a 和DNMT3b 過表達與SFRP1 異常甲基化呈負相關性可能。但國內尚未有同時在結直腸癌組織中檢測SFRP1、DNMT3a 和DNMT 3b 的表達情況及分析其相關性的研究。

故本研究通過免疫組織化學染色及Western Blot 蛋白印記法分別檢測結直腸癌組織和相應癌旁組織中SFRP1、DNMT3a 和DNMT 3b 蛋白的表達情況，分析相互之間可能存在的相關性及對結直腸癌發生、發展的作用，為DNMTs 抑制劑應用于臨床預防及治療結直腸癌提供依據。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集自2018 年2—10 月貴州省腫瘤醫院胃腸外科經臨床病理明確診斷為結直腸腺癌并經根治術后切除的結直腸癌組織及距病灶2cm 的癌旁組織各36 例，術前均未經放化療治療。36 例癌組織中男性18 例，年齡27 ～75 歲，平均年齡（58.22±14.26），女性18 例，年齡23 ～83 歲，平均年齡（57.83±14.72）；結腸癌19 例（包括右半結腸8 例，橫結腸2 例，左半結腸9 例），直腸癌17 例；高分化12 例，中分化14 例，低分化10 例；浸潤深度為T1+T2 的7 例，T3+T4 的29 例；有淋巴結結轉移的15 例，無淋巴結轉移的21 例；TNM 分期為Ⅰ、Ⅱ期的21 例，Ⅲ、Ⅳ期的15 例。

1.2 免疫組化法檢測目的蛋白

烤片60℃ 2h 后，常規脫蠟、水化，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶、檸檬酸緩沖液微波爐煮沸抗原修復、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3 次后，分別滴加經PBS 稀釋后的一抗，即SFRP1(1:200)、DNMT3b（1:400）、DNMT3a（1:600），同時以PBS 作為陰性對照，均放置于濕盒中4℃孵育過夜；復溫30 min，PBS 洗3 次后，37℃孵育相應二抗1h。PBS 洗3 次，二氨基聯苯胺(DAB)顯微鏡下染色，流水沖洗，蘇木素鏡下復染，流水沖洗后常規脫水透明、晾干，中性樹脂封片干燥后后鏡下觀察蛋白表達。

1.3 免疫蛋白印跡檢測

從-80℃冰箱取出癌組織及癌旁組織標本，每個標本稱取約100mg，按照蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，按比例加入1.5 倍緩沖液配置成蛋白樣品，震蕩混勻，100℃，煮沸10min，使蛋白充分變性，-20℃保存待用。用前解凍，上樣、電泳、轉膜、封閉、相應一抗即SFRP1(1:500)、β-catenin(1:500)、DNMT3A(1:300)、DNMT3B(1:300)4℃冰箱搖床孵育過夜。次日，經TBST 漂洗3 次后，用1%脫脂牛奶稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(1:8000)、兔抗羊IgG(1:8000)，室溫搖床慢搖孵育1h；洗膜后ECL 顯影曝光。檢測各目的蛋白的相對表達量，圖像采用 BIO-RAD 圖像處理軟件分析。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS22.0 統計學軟件分析處理，計數資料采用率（%）表示，行χ2檢驗，計量資料用均數±標準差（±s）表示，行t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。兩變量相關性采用Spearman 等級分析，均做雙側檢驗。

2.結果

2.1 SFRP1 蛋白在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況

免疫組織化學顯示：SFRP1 蛋白主要在結直腸組織的細胞質中表達，見圖1。SFRP1 在結直腸癌組織中陽性表達率（11/36，30.6%）顯著低于癌旁對照組織（27/36，75.0%），兩者之間差異具有統計學意義（P ＜0.05）。

圖1 免疫組織化學顯示SFRP1 在結直腸癌旁組織及癌組織中的表達（×200）

2.2 DNMT3a 蛋白在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況

DNMT3a 蛋白主要在結直腸組織的細胞核中表達，見圖2。其中DNMT3a 在結直腸癌組織中的表達（21/36，58.3%），高于癌旁對照組織（5/36，13.9%），兩者之間差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 DNMT3a 在結直腸癌組織及癌旁組織中免疫組化染色（×200）

2.3 DNMT3b 蛋白在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況

DNMT3b 蛋白主要在結直腸組織的細胞核中表達，見圖3。其中DNM T3b 在結直腸癌組織中陽性表達率（19/36，52.8%），高于癌旁組織（3/36，8.3%），兩者之間差異具有統計學意義（P ＜0.05）。

圖3 DNMT3b 在結直腸癌組織及癌旁組織中免疫組化染色（×200）

2.4 免疫蛋白印跡結果顯示

與癌旁組織比較（0.8±0.24），SFRP1 蛋白在結直腸癌組織中表達顯著降低（0.52±0.14），差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4；DNMT3a 蛋白和DNMT3b 蛋白表達在癌組織中均明顯增高，DNMT3a 蛋白在癌組織和癌旁組織的相對表達分別為3.94±0.31，1.38±0.23，DNMT3b 蛋白在癌組織和癌旁組織的相對表達分別為1.73±0.44，0.40±0.15，差異均具有統計學意義（P ＜0.05），見圖5、圖6。

圖4 Western blot 顯示SFRP1 在結直腸癌旁組織及癌組織中的相對表達

圖5 Western blot 顯示DNMT3b 在結直腸癌旁組織及癌組織中的相對表達

圖6 Western blot 顯示DNMT3a 在結直腸癌旁組織及癌組織中的相對表達

2.5 SFRP1、DNMT3a 及DNMT3b 表達與結直腸癌臨床病理資料之間的關系

SFRP1 及DNMT3a 的表達與患者的年齡、性別、腫瘤位置、大小及分化程度無顯著關系（P ＞0.05），但SFRP1 表達與腫瘤的浸潤深度、TNM 分期及淋巴結轉移相關（P ＜0.05）；DNMT3a 表達與TNM 分期、淋巴結轉移情況相關（P ＜0.05）。DNMT3b 蛋白表達與結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、位置、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移情況及TNM 分期均無關系（P ＞0.05）。

2.6 SFRP1 與DNMT3a、3b 在結直腸癌組織中表達的相關性

經Spearman 等級相關分析檢驗結果顯示，SFRP1 與DNMT3a、3b 表達均呈負相關（r=-0.540，P ＜0.05；r=-0.339，P ＜0.05），見表1、表2。

表1 結直腸癌組織中SFRP1 與DNMT3a 蛋白表達的關系

表2 結直腸癌組織中SFRP1 與DNMT3b 蛋白表達的關系

3.討論

結直腸癌的發生通過大量遺傳和表觀遺傳改變的積累，可能導致正常腸上皮轉化為浸潤性腺癌。SFRP1 作為腫瘤抑制基因，被證實能抑制細胞增殖、遷移和侵襲，促進CRC 細胞凋亡[10]。另外，王巍等[11]研究發現，結直腸癌組織中 SFRP1 mRNA 表達顯著低于癌旁組織，而結直腸癌組織中的SFRP1 甲基化頻率卻顯著高于癌旁組織，均說明SFRP1 甲基化可引起SFRP1 在結直腸癌中表達下調。本研究通過免疫組織化學染色檢測結直腸癌的癌組織及癌旁組織中SFRP1 蛋白表達結果顯示，相對癌旁組織，SFRP1 蛋白在結直腸癌組織中表達顯著降低，且SFRP1 表達下調與結直腸癌的浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期相關。免疫蛋白印跡檢測同樣發現SFRP1 在癌組織中的表達顯著低于癌旁組織中。由此得出，在結直腸癌中SFRP1 能抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，促進腫瘤細胞凋亡，其表達下降參與了結直腸癌的發生、發展。

DNA 甲基化是由DNA 甲基轉移酶(DNMTs)家族催化和維持的。本研究通過免疫組織化學染色檢測結直腸癌及癌旁組織中的DNMT3a 及DNMT3b 的表達，發現兩者在癌組織中的表達均顯著高于癌旁組織，同時在Western Blot 實驗中也得到相同結果。因此本研究從組織水平上證實了DNMT3a、3b 在結直腸癌中過表達，可能參與結直腸癌的發生，與過去研究結果一致。

過去部分研究[12]顯示，在結直腸癌中DNMTs 過表達與其靶基因DNA 甲基化有顯著關系，并導致其靶基因轉錄失活；并有學者探討DNMTs 過表達與靶基因之間可能存在的相關性，推測兩者之間可能存在負相關的關系。本研究免疫組化染色結果顯示SFRP1 在結直腸癌中表達顯著降低，而DNMT3a、3b 表達異常升高，通過相關性分析發現，SFRP1表達與DNMT3a、3b 表達均呈顯著負相關，所以推測在結直腸癌中，DNMT3a、3b 異常高表達可能促進了SFRP1 的異常甲基化，這將為臨床上DNA 甲基轉移酶抑制劑作為靶向藥物用于預防及治療結直腸癌提供理論依據。