vaspin、11β-HSD和IL-6在妊娠期糖尿病患者胎盤組織中的表達及其臨床意義

黃 娟

香港大學深圳醫院,廣東省深圳市 518000

妊娠期糖耐量異常表現為胰島素抵抗(IR)和糖代謝異常[1]。vaspin是一種新胰島素增敏脂肪細胞因子，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。近來相關研究認為其與T2DM存在一定的關系[2]。11β-HSD是參與糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptor,GR)預調節的重要代謝酶，其至少包括兩種亞型：11β-HSD1和11β-HSD2[3]。在體外培養中，IL-6上調了脂肪細胞內脂素的表達，但抑制了其在小鼠胚胎成纖維細胞(前脂肪)(3T3-L1細胞)中的表達，提示IL-6可能對脂肪細胞因子起調節作用[4]。本文研究對vaspin、11β-HSD和IL-6在妊娠期糖尿病患者胎盤組織中的表達情況進行了分析，并探討了上述三者的相關性，旨在為臨床提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年1—6月于我院產科行擇期剖宮產的40例孕婦作為研究對象。納入標準：(1)擇期剖宮產(非急診因素剖宮產，如順產中轉剖宮產等，盡量減少宮內感染因素)；(2)術中見羊水清(排除羊水糞染)；(3)排除合并各個系統的感染性疾病，比如呼吸系統感染、泌尿生殖系統感染等；(4)孕婦簽字已放棄胎盤。排除標準:(1)血糖控制不達標，或有酮癥、酮癥酸中毒病史；(2)合并高血壓、肝腎功能異常、多囊卵巢綜合征、胎膜早破等；(3)妊娠前有糖尿病史。按孕婦有無GDM分為GDM組(20例)和非GDM組(20例)。GDM組早孕期血糖正常，孕24～28周 75g糖OGTT結果符合國際糖尿病研究協會制定的GDM標準，平均分娩孕周為(38.8±0.8)周，平均年齡為(32.0±3.4)歲；非GDM組早孕期血糖正常，孕24～28周， 75g糖OGTT提示陰性，分娩平均孕周為(39.2±0.7)周，平均年齡為(33.3±4.3)歲。 兩組孕婦的一般資料比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 vaspin、11β-HSD及IL-6的測定

1.2.1 標本收集及處理：胎盤娩出后，在無菌操作下，從胎盤母體面中央位置取1.0cm組織方塊，用0.9%氯化鈉水溶液將其沖洗后置于EP管中，快速移至裝有液氮的冰壺中，置于-80℃冰箱儲存待檢。

1.2.2 實時熒光定量RT-PCR法：檢測胎盤組織中vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2及IL-6 mRNA表達:(1)按總RNA提取試劑盒[購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司]說明書提取胎盤組織的總RNA，并鑒定其純度和濃度。(2)按逆轉錄試劑盒(購自上海翊圣生物科技有限公司)說明書合成RNA的互補DNA:反應體系10μl。反應條件:37℃逆轉錄反應15min,再85℃5min滅活逆轉錄酶。(3)按美國國家生物技術信息中心(NCBI)建立的DNA序列數據庫中相關因子的NM序列號，設計合成引物，引物均由美國英杰生命技術有限公司(Invitrogen)合成。本次實施熒光定量RT-PCR實驗引進內參基因為GAPDH。引物序列見表1。(4)PCR反應體系:嚴格按試劑盒說明書操作，2×UltraSYBR Mixture(With ROX)10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDN A 8μl。(5)結果分析，以GAPDH作為內參，采用京科瑞達ABI7900熒光定量PCR儀計算vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2、IL-6 mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 BeWo細胞培養及細胞中vaspin含量測定 BeWo細胞購自譽弛(上海)生物科技有限公司，采用F-12K培養液，含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，在37℃、5%CO2、飽和濕度、pH 7.4孵育箱培養BeWo細胞，0.25%胰酶消化傳代，每3d換液傳代。接種BeWo細胞于六孔板中，1×106/孔，分別加入1、5、10ng/ml的IL-6，設置空白組。分別對不同濃度的IL-6設定時間梯度為12h、24h、48h、72h。收集不同濃度和時間的IL-6細胞，置于-80℃冰箱冷凍保存。用RT-PCR法分別測定細胞中vaspin含量，用有效作用濃度的IL-6作用BeWo細胞48h后，采用Western免疫印跡(WesternBlot)對細胞中vaspin蛋白表達情況進行分析。

1.4 A549細胞培養及細胞上清液中IL-6含量測定 將4×105個A549細胞鋪于T25細胞培養瓶中,置于含體積分數為0.01胎牛血清的DMEM-1640培養基中，37℃,5%CO2孵箱中培養24h后按脂質體轉染試劑說明書進行轉染，脂質體用量分別為6μl，重組質粒用量為3μg，用無血清和抗生素的培養液轉染，轉染后5h換成有血清和抗生素的培養液。將轉染后48h收取的細胞上清嚴格按EIISA試劑盒說明書測定IL-6含量。

2 結果

2.1 兩組胎盤組織中vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2及IL-6 mRNA及蛋白表達水平比較 兩組胎盤組織vaspin mRNA及蛋白表達水平差異均無統計學意義(P>0.05)；GDM組IL-6 mRNA及蛋白表達水平均明顯高于非GDM組，差異均有統計學意義(P<0.05)；GDM組胎盤11β-HSD1 mRNA和蛋白的表達明顯低于非GDM組差異均有統計學意義(P<0.05)；11β-HSD2 mRNA和蛋白表達水平明顯高于非GDM組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組胎盤組織中vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2 及IL-6 mRNA及蛋白表達水平比較

2.2 IL-6對BeWo細胞vaspin表達的影響 不同濃度的IL-6(1、5、10ng/ml)對BeWo細胞vaspin mRNA表達有抑制作用，10ng/ml濃度作用最明顯；10ng/ml IL-6在12、24、48、72h均可抑制BeWo細胞vaspin mRNA的表達，48h效果最明顯，蛋白表達也顯著降低，見圖1。

圖110ng/mlIL-6分別作用BeWo細胞不同時間點對

BeWo細胞中vaspinmRNA表達的影響

2.3 11β-HSD1、11β-HSD2重組質粒在A549細胞中表達的檢測 將重組質粒瞬時轉染A549細胞48h后，His抗體在轉染重組質粒細胞中可檢測到11β-HSD1和11β-HSD2的表達，而空載體轉染的細胞中沒有靶蛋白。轉染空載體和未經處理的細胞上清液中IL-6水平無顯著性差異(P>0.05)；轉染空載體的細胞上清液中IL-6的水平低于轉染11β-HSD2重組質粒的細胞上清液中IL-6的水平(P<0.05)，轉染空載體的細胞上清液IL-6水平高于轉染11β-HSD1重組質粒的細胞上清液中IL-6的水平(P<0.05)，見圖2。

圖2ELISA測定細胞上清中的IL-6表達水平

3 討論

GDM可引起子癇前期、巨大兒、肩難產、新生兒濕肺、新生兒高膽紅素血癥等母嬰并發癥，嚴重影響母嬰健康和生命安全。當前，GDM的發病機制與IR存在一定的關系。vaspin是一種新的胰島素增敏脂肪細胞因子，與IR存在緊密的關聯，近來有研究認為其與T2DM的發生有關[5-6]。GDM患者vaspin水平存在差異的研究結果存在差異。本文研究結果顯示，GDM組胎盤組織vaspin表達水平與非GDM組比較，無顯著差異(P>0.05)。

IL-6是一種由T細胞、脂肪細胞、B細胞等多種細胞合成的多功能細胞因子。是患者炎癥反應十分關鍵的細胞因子。IL-6在GDM發病中的作用機制可能是：(1)抑制糖原合成酶，刺激肝糖原釋放，導致血糖升高；(2)誘導瘦素抵抗，并通過與瘦素共享信號轉導途徑抑制瘦素信號轉導，降低了對胰島素分泌的抑制作用；(3)通過肝細胞作用抑制胰島素受體底物-1(Insulin receptor substrate，IRSs-1)酪氨酸磷酸化，導致IR。IL-6是GDM發病過程中十分關鍵的脂肪細胞因子[7-9]。本文研究顯示，GDM組IL-6表達水平高于非GDM組(P<0.05)。與相關研究結果一致。

本文研究發現不同濃度的IL-6對BeWo細胞vaspin mRNA表達有抑制作用，10ng/ml濃度作用最明顯；10ng/ml IL-6在不同時間點均可抑制BeWo細胞vaspin mRNA的表達，48h效果最明顯，蛋白表達也顯著降低。相關研究發現，GDM組孕中期血清vaspin略降低、而IL-6水平升高，vaspin與IL-6呈負相關關系，因此認為，脂肪細胞因子vaspin受炎癥因子IL-6的影響[8-10]。IL-6調節IR的機制尚未明確，當前產生了兩種理論分歧：(1)IL-6升高可影響肝細胞IR，促進全身性IR的發展。(2)體外研究顯示，在胰島素信號轉導途徑和糖代謝負向調節過程中，IL-6是脂肪細胞的作用靶點[11-12]。

本文研究還發現轉染空載體的細胞上清與未處理的細胞上清相比IL-6水平無顯著差異(P>0.05);轉染空載體的細胞上清IL-6水平低于轉染11β-HSD2重組質粒的細胞上清IL-6水平(P<0.05)，轉染空載體的細胞上清IL-6水平高于轉染11β-HSD1重組質粒的細胞上清IL-6水平(P<0.05)。11β-HSD對于調節GR前作用十分關鍵，其包括11β-HSD1和11β-HSD2兩個亞型，通常認為11β-HSD1可提升GR濃度和活性，保護內皮細胞免受GR的炎性損傷，而11β-HSD2會降低GR濃度和活性，增大GR對內皮細胞的損傷[13-14]。有研究結果顯示，在川崎病患兒急性期，11β-HSD1 mRNA水平較對照組明顯升高，同時11β-HSD2 mRNA水平較對照組明顯降低，提示11β-HSD活性改變是川崎病急性期炎癥反應的重要調節因子[15-17]。

綜上所述，GDM組與非GDM組vaspin mRNA和蛋白表達無顯著性差異，IL-6可抑制BeWo細胞vaspin的表達，提示vaspin與炎癥存在一定的關系。GDM組11β-HSD1低表達，11β-HSD2高表達。它們與胰島素、脂質代謝紊亂及胎盤炎癥反應相關，但其具體作用機制尚需進一步完善。