MSTN打靶豬的安全性分析

李誠瑜，劉昭君，申 明，李榮陽，陶景麗，吳望軍，劉紅林

（南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095）

1 MSTN基因簡介

Myostatin（MSTN）基因，中文名為肌肉生長抑制素基因，是轉化生長因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族成員之一，是一種抑制肌肉生長發育的負調控因子[1]。在胚胎發育階段，MSTN在生肌節細胞和發育的骨骼肌中表達，對肌纖維的數量起著非常重要的調控作用。在成年動物體內，MSTN在骨骼肌中特異表達，能有效控制肌纖維的生長[2,3]。而大量的研究發現，MSTN基因敲除和自然純合突變的小鼠、牛、狗和人類均表現出骨骼肌肥大的現象[4-7]。因此，MSTN是一個在多物種中影響肌肉生長發育的重要功能基因。

2 動物遺傳修飾的概念與理解

動物遺傳修飾（Genetic Modification）是指人為改變動物的基因組（遺傳物質），主要包括轉基因與基因敲除。轉基因動物（Transgenic Animal）是指利用實驗方法將外源基因導入動物染色體基因組內，外源基因能在動物體內表達并穩定遺傳給后代的一類動物[8]。轉基因動物的起源要追溯到1982年由Palmiter實驗室做出的世界首例轉基因小鼠[9]。自此，轉基因動物技術已在多個物種之中得到應用，包括豬、牛、羊、兔、鼠、魚等[10-12]。基因敲除是指采用基因組編輯技術去除基因組某個固有基因的部分序列，從而導致該基因功能下降或缺失[13]。

3 動物基因編輯技術

基因編輯技術（Genome Engineering Technologies）是指對基因進行定點敲除或插入從而實現對基因功能的改造的一種技術，又稱基因打靶技術，目前已經被廣泛應用于各種動物基因組的修飾中[14]。目前主要的基因編輯技術包括：巨核酶技術（Meganucleases）、鋅指核酸內切酶（Zinc Finger Endon-uclease，ZFN）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN）、Cre/loxP系統、CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palind-romic Repeats-CRISPR-Cas9-associated proteins）技術、SGN技術，以及目前備受爭議NgAgo技術，其中研究最熱的屬基因組編輯技術當屬CRISPR-Cas9系統[15,16]。CRISPR-Cas系統主要分為3種類型，其中Ⅱ型CRISPR-Cas系統最為簡單，其利用gRNA結合到目的基因片段引導Cas9蛋白將DNA雙鏈切斷，實現基因的定點修飾。CRISPR-Cas9系統相對其他基因編輯技術有設計操縱更加簡便、編輯更加高效、通用性更廣等優勢，已經成為新一代基因組編輯技術，將為基因組定向改造調控與應用等帶來突破性革命，為產生新的、基因編輯更加高效的轉基因動物帶來新的契機[17]。

4 MSTN基因編輯豬的安全性分析

隨著基因編輯技術的飛速發展，世界各地相繼報道了多種轉基因動物。運用基因編輯技術科學家們可以定點、定時地對動物基因組進行基因的敲除與插入。為了獲得肌肉量更多的動物，利用基因編輯技術敲除或改造肌肉生長抑制因子MSTN基因，使之失去對肌肉生長發育抑制的功能，從而生產出產肉率高的MSTN基因編輯動物不失為一種高效的生產手段。那么通過基因編輯技術所獲得的MSTN打靶豬產肉量是否能提高，其所生產的豬肉是否與普通豬一樣安全？

近年來，轉基因動物的安全性受到社會各界的廣泛關注，其安全性和食品安全問題也是社會各界討論的熱點話題。轉基因技術給人類創造巨大利益的同時，也帶來巨大挑戰，有人認為轉基因動物可能對人類和生物環境產生重要影響，例如過敏性反應、抗藥性問題、基因污染等問題。目前關于轉基因動物安全性評價尚無統一標準，按照我國最新修訂的文件來看，轉基因動物安全性評價包括以下幾個內容：分子特征、遺傳穩定性、健康狀況、功能效率評價、環境適應性、轉基因動物逃逸及其對環境的影響和食用安全[18]。

動物轉基因技術相較于克隆技術，其產品的食用安全性也存在著較大爭議，世界糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）為此成立了專門的專家組討論轉基因動物產品的食用安全性評價策略。目前最為普遍認可的是“實質等同性原則”[19]，即指出如果某個新食品或食品成分與現有的食品或食品成分大體相同，那么它們是同等安全的。“實質等同性原則”包括3方面內容：被轉入基因的分子特征分析、轉基因動物組織的形態分析、所構成食物的成分分析。

針對利用基因編輯技術生產的高產肉性能的豬肉是否能安全食用這一熱點問題，大量的MSTN相關文獻的結論偏向于MSTN基因編輯豬是安全的。

4.1 MSTN基因編輯豬無外源基因的整合

MSTN基因編輯豬只是利用基因編輯技術將其中一條染色體上的等位基因片段敲除了一部分，目的是使MSTN抑制肌肉生長發育的功能失活或減弱，并沒有外源基因整合到豬的基因組當中去；另外，為了降低MSTN基因編輯豬表型異常的概率，對目標基因只是進行了單等位基因的編輯，也即只是減弱了MSTN抑制肌肉生長發育的效應，而并沒有完全使之失活，這樣生產出來的MSTN基因編輯豬與普通豬相比，其他表型沒有太大差異。

4.2 無抗性標記

傳統的轉基因動物在生產前期工作中，為了獲得陽性轉基因細胞系，在細胞篩選過程中大多帶有抗性標記，抗性標記的存在可能會導致潛在的食用安全風險。而MSTN基因基因編輯豬完全是不帶有抗性基因，因此，不存在由抗性標記基因帶來的潛在風險。

4.3 自然界早已存在MSTN基因突變的家畜動物

近200年前就有人發現有些牛的肌肉異常發達，而在1997年時，美國科學家ALEXANDRAC.MCPHERRON發現比利時藍牛和皮埃蒙特牛都存在MSTN的自然突變，比利時藍牛MSTN基因第3外顯子上發生了11bp的缺失突變，該缺失導致MSTN蛋白的移碼突變，MSTN抑制肌肉生長發育的功能受到抑制[20]，這種突變的比利時藍牛全身肌肉異常發達，具有特別明顯的雙肌臀表型（如圖1與圖2所示）。而皮埃蒙特牛MSTN基因第3外顯子上發生G/A錯義突變，使酪氨酸轉變為半胱氨酸，其突變同樣也會引起皮埃蒙特牛雙肌臀表型[21]。

另外，在羊上的研究同樣發現，在特塞爾綿羊（Texel sheep）MSTN基因g+6223G/A突變導致了miR-1與miR-206的結合位點缺失[22]，從而使MSTN蛋白翻譯受阻，最終導致了特塞爾綿羊肌肉的肥大（如圖3所示）。

如今，科學家在不同物種雙肌臀個體MSTN基因中發現了多種不同的突變，包括移碼、終止和缺失突變等，幾乎包含了所有突變類型。無論哪種突變，其結果都是改變MSTN基因抑制肌肉生長的效應，導致雙肌臀表型的出現。由此可見，MSTN基因在自然界本身就存在許多天然突變，至今尚未見因食用這些突變物種的肉導致不適的報道。

綜上所述，通過基因編輯技術生產的MSTN打靶豬是安全的，它將為我們培育產肉量多的新品系豬提供新的契機與渠道。