肝卵圓細胞的起源、標志物及潛在臨床應用

楊芊，張玥，吳佳俊，潘艷芳

(1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.醫學技術學院，陜西 咸陽 712046)

0 引言

哺乳動物的肝臟損傷后具有強大的再生能力，一方面是通過肝細胞的自我更新能力，另一方面便是通過肝卵圓細胞(hepatic oval cells,HOC)的增殖分化能力。即使切除三分之二的肝組織，數周之內肝臟可再生并且恢復到其正常水平。是具有多向分化潛能的肝干細胞，在正常情況下，肝卵圓細胞處于靜止狀態，不會在正常的成體肝組織內檢測到，只要當肝組織受到嚴重損傷時或者肝再生能力受到抑制時，肝卵圓細胞才會被激活，進一步向肝細胞和膽管細胞進行分化[1]。因此，肝卵圓細胞對于肝再生有著重大的作用。肝卵圓細胞在各種原因所導致的肝硬化，脂肪肝，肝癌等終末期肝性疾病的治療方面有著廣闊的發展前景，但是就目前形勢來看，肝卵圓細胞移植此方法僅在動物身上所做實驗較多，還沒有完全應用于人類臨床。但是毋庸置疑的是，肝卵圓細胞無疑是肝移植的一個良好的細胞來源，未來的臨床前景是無限的。深入研究肝卵圓細胞的來源、特異性標志物、在肝臟再生中的作用及潛在臨床應用非常重要。然而目前研究對肝卵圓細胞的上述生物學特性仍然尚未完全闡明，這嚴重制約了肝卵圓細胞的應用前景。本文對肝卵圓細胞的起源、標志物、肝再生及臨床應用前景進行綜述，為該細胞在未來的臨床應用提供理論基礎。

1 肝卵圓細胞的來源

目前對肝卵圓細胞的存在已經形成共識，但對其起源尚存在爭議，主要有以下5 種來源。分別為：(1)膽道上皮細胞；(2)胎兒肝中存在的祖細胞；(3)骨髓細胞；(4)肝星狀細胞；(5)成熟的成年肝細胞[2]。

1.1 來源于膽管上皮細胞

許多研究表明膽管上皮細胞在肝臟中起著兼職干細胞的作用。因此，這些分化的細胞可能會在特定條件下獲得干細胞樣特征[3]。最近的工作有證明了蛋白質標記物在探索肝星狀細胞(hepatic stellate ceils，HSCs)的生理功能中的實用性。不幸的是，許多廣泛使用的標志物，例如EPCAM(epithelial cell adhesion molecule EPCAM、CD133、Sox9、OPN(osteopontin OPN) 在 受 損肝臟的卵圓細胞和健康肝臟的膽管細胞和/或非實質細胞中均被發現[4-5]。此外，據報道兼性HOC 表達CK19 和MIC1-1C3[5]。上述標記的應用由于缺乏細胞類型的特異性而受到限制。FoxI1 (Forkhead box I 1)，Trop2(encoded by tumor-associated calcium signal transducer 2 Trop2)、Lgr5 (1eucine—rich—repeat—containing G protein— coupled receptor 5)是三個的標記，僅出現在受傷肝臟的卵圓細胞[6]。此外，Foxl1 +細胞和Trop2 +細胞表達EPCAM 和CK19 以及表達Lgr5 的類器官可以從培養中的膽管碎片中生長出來，進一步支持了至少某些類型的肝卵圓細胞可以起源于自膽管細胞。此外，基因表達分析比較了Foxl1 + 的HOC、膽管細胞、肝細胞，結果發現Foxl1 +的基因表達譜肝卵圓細胞類似于膽管細胞而不是肝細胞，從而支持肝卵圓細胞來源于膽管細胞[6]。

此外，許多報告表明，肝卵圓細胞的增殖隔室是與先前存在的小管相連。有趣的是，盡管在正常和受損肝臟中均發現了CD133 +細胞，但只有CD133 +細胞從受傷的肝臟中分離出來的病毒可以自我更新[7]。Kamiya 等人發現健康人體內存在 “膽管細胞前體細胞”[8]。這些細胞在體內可以表達CD13，體內整合素α6(ITGA6 或CD49f)、CD133 和CK19。當這些細胞在體外培養后，它們可以自我更新，并開始表達肝卵圓細胞的標記CD44 和肝細胞的標記白蛋白。這些結果進一步支持了膽管細胞可以作為兼性肝卵圓細胞的前體。

1.2 胎兒肝中存在的祖細胞

肝母細胞是在胎兒肝臟中發現的雙能細胞(在小鼠中介于E9.5 和E14.5 之間)，具有在體內分化為肝細胞和膽管細胞的能力。由于肝母細胞和HOC 都有增殖能力，并能夠分化為肝細胞和膽管細胞，因此認為肝卵圓細胞起源于肝母肝細胞[9]。事實上胚母細胞和肝卵圓細胞具有相同的標記物，例如δ樣1 同源物和甲胎蛋白(AFP)這些都是HOC 來源于肝母細胞的證據。胎兒細胞還具有肝卵圓細胞的其他特征，例如克隆形成性和體內重新填充肝臟的能力。例如，鼠胎兒肝細胞的CD13 + DLK +的細胞具有在培養物中形成聚集的能力[10]，以及來自大鼠胎肝AFP + CK19 +的細胞具有在體內再形成肝臟的能力[11]。大多數研究都沒有在健康的未損傷肝臟中觀察到CD13 + DLK +或AFP + CK19 +細胞的水平，這反駁了在成年器官中繼續存在胎兒成肝細胞。此外，成人肝臟中AFP 的表達不足以證明是來自胎兒肝母細胞的后代，這很可能是在成年兼性肝卵圓細胞中重新激活AFP 啟動子(或其他胎兒表達基因的啟動子)的情況。

1.3 來源于骨髓

在1999 年，Petersen 等人將雄性大鼠的骨髓移植到雌性大鼠中時，0.14%的肝細胞帶有Y 染色體[12]。他們還報道了骨髓來源的細胞能夠分化為肝細胞，盡管它們對肝實質的貢獻程度不到1%。肝卵圓細胞和造血干細胞表達相同的標記這一事實進一步支持了肝卵圓細胞可能源自骨髓的假說，如Thy1，CD34、Kit。隨后，兩個獨立的小組移植了骨髓細胞，并在富馬酰乙酰乙酸水解酶(FAH)缺陷的小鼠肝臟中檢測到了供體來源的肝結節。然而，隨后證明源自移植骨髓細胞的FAH 陽性的肝細胞是細胞融合的結果，而不是骨髓細胞實際分化為肝卵圓細胞或肝細胞的結果[13]。為了解決這一差異，兩個獨立的研究小組分別移植了表達GFP 的骨髓細胞或lacZ 轉基因骨髓細胞，并證明當受體小鼠遭受了CCl4，ANIT，DDC 或CDE 飲食介導的肝損傷，受體小鼠骨髓細胞在肝再生中的作用微不足道。同時也證明了骨髓細胞大鼠的肝卵圓細胞和肝細胞沒有幫助。2007 年，Piscaglia 等的研究證實，粒細胞集落刺激因子可以通過促進骨髓來源的前體細胞遷移至肝臟從而參與肝組織的修復過程，并且粒細胞集落刺激因子能夠促進肝卵圓細胞的激活和增殖[14]。但同時也有研究表明，骨髓來源的細胞可以遷移到肝臟，但并未分化為肝膽管細胞，肝細胞，肝卵圓細胞，也并未表達肝組織相關的抗原。由此可見，雖然骨髓來源的細胞在肝臟再生修復過程中發揮重要作用，但并未通過未分化的肝卵圓細胞發揮作用[15]。

1.4 來源于肝星狀細胞

肝星狀細胞是一種可分泌細胞外基質的肝臟細胞，具有重要的生物功能。其靜息狀態時儲存有大量的類維生素A，存在于肝竇內皮細胞和肝細胞之間Disse 間隙內，Disse 間隙具有干細胞小體的特點，激活后可分化為肌成纖維細胞，金額熱導致肝纖維化的發生[16]。目前也有研究發現，它具有向間充質干細胞的特征，體外培養過程中某一時段表達的基因與肝卵圓細胞類似，可以分化為成熟的肝細胞[17]。但是與此同時，也有研究發現，在肝損傷的小鼠的肝組織中，肝星狀細胞并不能分化為上皮細胞。因此，關于肝卵圓細胞是否來源于肝星狀細胞，還需要進一步的研究。

最近的報告提出將肝星狀細胞作為一種肝卵圓細胞。這項研究是基于使用星形膠質細胞標記神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)通過Cre-loxP 技術進行遺傳譜系追蹤。當給小鼠喂食MCDE 飲食時，Gfap-Cre 標記的細胞有助于肝卵圓細胞區室[18]。而使用的Gfap-Cre 驅動程序不僅在肝星狀細胞中活躍，而且在膽管細胞的一部分中也活躍。因此，作者無法排除在小鼠中觀察到的兼性HOC 由膽管細胞產生的可能性。實際上，Scholten 等人的后續研究表明星狀細胞不會對肝卵圓細胞區域起作用[19]。鑒于星狀細胞與肝細胞和膽汁細胞(分別來自中胚層和內胚層)來自不同的胚芽層，因此星狀細胞進入肝卵圓細胞可能需要太大的基因表達程序變化才能自然發生。

1.5 成熟的肝細胞

最近，Yanger 和Stanger[3]提出，肝細胞可以經歷重編程為膽道譜系。他們將AAV8-TBG-Cre 注射到RosaYFP 小鼠體內，以在成年肝臟中沿追蹤完全分化的肝細胞經過DDC 處理后，出現了同時表達膽汁制造者A6 和肝細胞標志物HNF4α的細胞。這些A6+HNF4α+細胞中有41%是雙核的，對YFP 的染色進一步證實了這些細胞起源于肝細胞。他們鑒定出大量獲得膽道形態并表達OPN，A6，Sox9 或CK19 的YFP+細胞。他們還確定了在DDC 喂養的小鼠肝臟中的雙核HOC，但在對照小鼠的肝臟中沒有。這些結果表明，肝臟損傷時，肝細胞可以分化為膽管細胞和/或HOC。

2 肝卵圓細胞標志物

肝卵圓細胞的標志物在對其功能研究中具有重要意義。肝卵圓細胞處于膽管上皮細胞和肝細胞之間相互轉化過程的各個不同階段，但是肝卵圓細胞在損傷修復過程中的位置，表型及存在形式都飽受爭議。目前有研究試圖通過細胞表面標志物對肝卵圓細胞進行篩選區分，但尚未找到統一的表面標志物，同時在研究中證實肝卵圓細胞并非來源于已分化成熟的肝細胞[20]。

肝臟的再生過程很復雜，是一個包括多種細胞增殖，由多條通路、多種因素共同參與的一種復雜而又精確的調控過程，隨著分子生物學技術的突飛猛進，近年來隨著對肝卵圓細胞研究的不斷深入，已經確立了一些肝卵圓細胞高度表達的分子標志物。依據其表達于細胞部位的不同，將其分為3 類：細胞膜類、細胞胞質類、細胞胞核類。

(1)CD 分子類：CD 分子為細胞分化分子，在細胞分化增殖遷移中發揮重要的作用.在肝卵圓細胞增殖模型中，研究發現大量增殖的肝卵圓細胞表面表達多種CD 分子：CD24、CD44、CD90、CD133.CD24 是一種高度糖基化蛋白質分子，與細胞黏附有關，CD24的表達參與了細胞的遷移，并調節細胞生長增殖[21]。

(2)受體類：在構建大鼠肝損傷模型后，通過實驗觀察可發現，在肝臟再生修復的過程中，增殖的肝卵圓細胞可以表達多種受體，如：CTGF 受體、HGF 受體、SCF 受體、IFN 受體等。這些受體對肝卵圓細胞的增殖，分化起著重要的作用。

(3)大量增殖的肝卵圓細胞還表達分子：OV-1，間質細胞分子標志物：波形蛋白、內皮蛋白、成骨蛋白7；Dorr el l 等應用DDC( 1，4 二氫 3，5 吡啶二甲酸二乙酯)誘導的肝卵圓細胞增殖的模型中，發現大量增殖的肝卵圓細胞表達分子OC2-1 C6，OC2.2A6，OC2.6E10，同時，表達膽管上皮細胞分子標志物：MIC1.1 C3，OC2.1 D11，OC2.2F3；這些在肝卵圓細胞的細胞質中表達的多類型細胞標志蛋白，為肝卵圓細胞多向性分化提供依據[22]。

盡管肝卵圓細胞表面標志物很多，但是要尋找一個相對穩定并且特異的肝卵圓細胞標志物還具有一定的困難，需要我們進一步的探索。

3 肝卵圓細胞與肝再生

在人類以及嚙齒動物的各種疾病中都發現了的HOC 的擴增。但是，雖未得到證實，但HOC 對恢復肝實質結構和肝功能的貢獻已被假定[23]。到目前為止，已經證明HOC 形成了管腔典型和非典型導管[24]，但尚不清楚這些導管是否功能齊全。雖然在培養細胞中形成管狀結構已被用作HOC 分化為膽管細胞的能力的指標[8]，但該測定法并未提供確定的證據支持HOC 衍生的膽管細胞已完全整合到膽道樹中。現在仍缺乏支持內源性HOC 在體內形成功能性導管這一假說的確鑿證據。

直到最近，HOC 對肝細胞的貢獻也引起了爭論。使用Foxl1-Cre 進行遺傳譜系追蹤；RosaLacZ 小鼠證明BDL 后2周，β-gal+/HNF4α+細胞的數量顯著增加，表明Foxl1-Cre 標記的HOC 可以形成新的肝細胞[25]。此外，在多種疾病模型(例如PH，DDC，BDL 和CCl4)中采用了腺相關病毒載體AAV8-Ttr-Cre 結合RosaYFP 小鼠進行肝細胞命運追蹤[26]。作者發現了來自祖細胞的新形成的肝細胞細胞，盡管貢獻有限。同樣，另一組報道了2-AAF/PH 大鼠模型中存在稀有的CK19+或GSTP+ CK19-中間肝細胞[27]。在人類中，表達CK7 或也已經觀察到CK19[28]。Sackett，Gao 等人證明了BDL 后Foxl1-/-小鼠的導管反應受損與肝再生受損之間的相關性。在BDL 后14天，Foxl1-/-肝臟中CK19 +導管區域的擴張減少，而對照肝臟則CK19+導管區域逐漸增加。與對照小鼠相比，Foxl1-/-小鼠中這種作用與血清AST 水平升高，肝細胞增殖延遲和實質壞死增加有關。這些結果強烈支持HOC 有助于肝臟再生的觀點[25]。同樣，高瀨等證明，DDC 誘導的損傷后，成纖維細胞生長因子7(FGF7)的強制表達導致HOC 反應增強，同時肝損傷和死亡率降低。在HPC 反應期間肝臟中誘導產生的FGF7 可刺激HOC的增殖[23]。

與對照小鼠相比，Fg f7 轉基因小鼠中A6+ CK19+ 肝卵圓細胞周圍新形成的A6+ CK19-肝細胞急劇增加。他們證明Fgf7 缺陷型小鼠的HOC 降低DDC 治療后血管擴張，死亡和肝損傷更高[23]。在HOC 激活過程中ECM 沉積會阻止子代向薄壁組織擴展和遷移。當小鼠先接受CDE 飲食3 周，然后再進行2 周減脂飲食時，與僅接受CDE 飲食的小鼠相比，iCreERT2 +HPC 顯著增加，這表明HOC 可能在恢復階段而不是疾病發展過程中發揮作用[29]。總而言之，HOC 會在損傷后促進肝實質增生，盡管在測試的實驗模型中這樣做的貢獻可能很小，但擴增的HOC 仍可能是治療肝病的目標。

4 肝卵圓細胞的臨床應用以及可能存在的問題

目前，對于治療終末期的肝臟疾病最有效的方法就是進行肝移植。但是不是所有人都能承受高昂的費用以及肝移植后的副作用，而HOC 用于細胞治療是器官移植治療肝病的一種有吸引力的替代方法。首先，單個HOC 可以在培養物中擴增而不會失去其雙向分化潛能[7]。其次，很多肝臟疾病中發現了HOC，表明HOC 可以是從患病肝臟中分離的。第三，有可能從患有肝病的患者中分離HOC，在培養中進行擴增，然后再移植回患者。這種自體移植方案將消除移植后的免疫抑制。最后，HOC 比肝細胞小，并且有人建議較小的細胞從門靜脈注射后較少出現門脈高壓[30]。但與此同時，肝卵圓細胞應用于臨床也可能存在諸多問題。(1)肝卵圓細胞的分離與純化目前僅僅在動物模型上得到了進展，尚未在人體上進行。卵原細胞在人體中僅存在于肝臟和骨髓中，在人體中進行肝卵圓細胞的分離與純化上有一定的風險，目前，如何在人體中能夠安全有效的分離出卵原細胞以及如何調控肝卵圓細胞是目前研究的一個難點。(2)對于人體肝卵圓細胞的分離純化的操作還不太成熟，還需要慢慢摸索，同時對于肝卵圓細胞在人體中促進肝臟再生的信號轉導以及傳導通路還需進一步研究。(3)盡管有研究表明，肝卵圓細胞移植對于治療終末期的肝臟疾病有作用，應用前景很光明，但是在應用于臨床之前仍有很多的難題等待我們去解決[31]。

5 結論

肝卵圓細胞對于治療終末期肝臟疾病有很大的應用前景，可以作為代替肝移植進行肝臟疾病的治療的一種新型治療手段。但是，還需要進行進一步研究來論證來自不同研究小組的不同結果，以期未來可以應用于臨床。