細(xì)胞DNA Feulgen快速染色方法

賀海云，朱紅霞

(新疆克孜勒蘇柯爾自治州克州人民醫(yī)院病理科，新疆 阿圖什 845350)

0 引言

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。惡性腫瘤已成為一個(gè)重要的死亡原因。中國(guó)癌癥死亡總?cè)藬?shù)占全球的近1/4[1]。癌癥對(duì)我國(guó)乃至世界的公共衛(wèi)生服務(wù)提出了更高的要求，因此惡性腫瘤的早期篩查、診斷和治療顯得尤為重要。

目前，惡性腫瘤的篩查方法主要基于細(xì)胞病理學(xué)方法。但這種方法受各病理學(xué)家診斷水平的影響，主觀性強(qiáng)，不可避免地會(huì)導(dǎo)致一些誤診和漏診。隨著現(xiàn)代分子病理檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，DNA 定量細(xì)胞病理倍體分析得到廣泛應(yīng)用，為惡性腫瘤的早期診斷和篩選提供了重要的檢測(cè)手段。DNA的標(biāo)準(zhǔn)染色方法是Feulgen 染色法，而DNA 核圖像定量分析是一種相對(duì)客觀、可控的新的病理診斷技術(shù)，能較早地反映惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。大量研究表明，細(xì)胞核DNA 圖像分析對(duì)惡性腫瘤的早期診斷、治療和預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義[2]。Feulgen 染色是Feulgen 和Rossenbeck于1924 年發(fā)現(xiàn)的一種核內(nèi)DNA 染色技術(shù)。Feulgen 染色已成為DNA 圖像定量分析的標(biāo)準(zhǔn)[3]。然而，現(xiàn)有的經(jīng)典Feulgen 染色法耗時(shí)較長(zhǎng)，耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)4 小時(shí)。建立了一種快速Feulgen 染色方法，并與經(jīng)典Feulgen 染色法進(jìn)行了比較。這種快速Feulgen 染色方法可用于圖像分析系統(tǒng)中細(xì)胞核DNA 含量和倍性的測(cè)量與分析。可滿足臨床快速病理診斷的要求。

1 材料與方法

1.1 材料

從我院婦科門診部采集宮頸癌標(biāo)本100 例，進(jìn)行宮頸癌篩查和檢測(cè)。每個(gè)樣品均采用液基法制備，隨機(jī)分為經(jīng)典組和快速組，分別染色。經(jīng)典組用常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)程序染色4 小時(shí)，快速組用快速Feulgen 法染色30 分鐘。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 BS 固定溶液配置

測(cè)量甲醇160mL(80%)、甲醛30mL(15%)和冰醋酸10mL(5%)，混合后放入儲(chǔ)瓶中儲(chǔ)存。60%磷酸：將120mL(60%)磷酸和80mL(40%)蒸餾水混合。DNA 染色液(廈門麥克奧迪有限公司提供)按60%磷酸和蒸餾水的比例配制。向細(xì)胞DNA 染色液中加入196mL 蒸餾水，加入0.2g 硫堇和0.2g 偏亞硫酸鹽，在棕色試劑瓶中磁力攪拌4mL60%磷酸，于使用當(dāng)天制備。染液在35℃恒溫箱中攪拌過濾60 分鐘。過濾后立即密封染料溶液，并將其儲(chǔ)存在培養(yǎng)箱中臨時(shí)儲(chǔ)存。染料溶液應(yīng)為藍(lán)紫色。梯度乙醇(50%、75%、95%乙醇各一缸，無水乙醇兩缸)。

1.2.2 儀器

Motic DNA 圖像分析系統(tǒng)、液基制片機(jī)，DNA 染色機(jī)(麥克奧迪集團(tuán)有限公司)，生化培養(yǎng)箱。

1.3 方法

二組染色均由DNA 染色機(jī)染色。

1.3.1 經(jīng)典Feulgen 染色法的標(biāo)準(zhǔn)組步驟如下

(1)用BS 固定液固定50 分鐘(25℃)；(2)用自來水沖洗； (3)用60%磷酸水解60 分鐘(25℃)；(4)用自來水沖洗；(5)硫堇染色60 分鐘(25℃)；(6)后用自來水沖洗，蒸餾水洗滌15 分鐘(25℃)；(7)用梯度乙醇脫水，過二甲苯，滴中性膠封；(8)掃描和圖像分析。

1.3.2 快速Feulgen 染色法

首先將快速Feulgen 染色固定液、60%磷酸、染色液和蒸餾水預(yù)先預(yù)熱到60℃。(1) 在BS 固定液中固定5 分鐘(60℃)； (2)用自來水沖洗；(3)用60%磷酸酸水解10 分鐘(60℃)；(4)用自來水沖洗；(5)在DNA 染色液中染色10 分鐘(60℃)；(6)用自來水沖洗，然后用水浸泡1 分鐘；(7) 脫水：用梯度乙醇、對(duì)二甲苯和中性膠脫水；(8) 所有的Feulgen 染色片均采用麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司的全自動(dòng)細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并檢驗(yàn)兩組的一致性。計(jì)算兩種方法測(cè)得的IOD 和CV 的95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 在顯微鏡下用兩種染色圖像分析方法檢測(cè)效果，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞核染色深，背景干凈。見圖1。

圖 1 經(jīng)典 Feulgen 染色法 快速 Feulgen 染色法

2.2 二兩種染色方法對(duì)宮頸標(biāo)本二倍體細(xì)胞核IOD 和CV 值一致性的影響，用麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司提供的Moticymeter進(jìn)行掃描，并用Classify 分析系統(tǒng)對(duì)每組常規(guī)標(biāo)本和每組標(biāo)本的直方圖和散點(diǎn)圖(圖2)進(jìn)行分析。測(cè)量宮頸標(biāo)本細(xì)胞核的積分光密度(IOD)，計(jì)算二倍體細(xì)胞核的平均IOD 值，以IOD 平均值作為二倍體細(xì)胞核DNA 含量的代表值。DNA 含量差異用CV 表示。CV=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%，由系統(tǒng)自動(dòng)生成。

2.3 兩種染色方法對(duì)IOD 和CV 值一致性的影響100 例宮頸標(biāo)本經(jīng)典染色法IOD 值平均值為116.314，快速染色法為115.257，兩者比較接近。一致性檢驗(yàn)結(jié)果表明，兩種染色方法的IOD 一致性較好。經(jīng)典染色法的CV 值為8.263，快速染色法的CV 值為7.849。一致性檢驗(yàn)結(jié)果表明，兩種染色方法的CV 值一致，如表1 所示，表明快速Feulgen 染色法具有較高的重復(fù)性。

表1 種染色法所得100 例宮頸標(biāo)本二倍體細(xì)胞核IOD、CV 值情況

3 討論

Feulgen 染色已廣泛應(yīng)用于DNA 圖像分析系統(tǒng)所測(cè)細(xì)胞核的定量分析[4],根據(jù)DNA 染色的機(jī)理，F(xiàn)eulgen 染色仍然是DNA 圖像分析系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)染色方法之一，而酸化水解在染色反應(yīng)中起著非常重要的作用，其原理是細(xì)胞DNA 酸化水解后，脫氧核糖和嘌呤之間的糖苷鍵斷裂。脫氧核糖的末端與醛接觸，與染色液中硫堇和亞硫酸鹽的中間產(chǎn)物結(jié)合，形成藍(lán)紫色化合物?？焖貴eulgen 染色法采用高濃度磷酸高溫酸化水解法，顯色結(jié)果呈藍(lán)色，使DNA 染色效果也達(dá)到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，克服了經(jīng)典Feulgen 染色時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4 小時(shí)，縮短到25 分鐘的缺點(diǎn)，從而大大提高了DNA 染色的質(zhì)量為DNA 含量分析在快速病理診斷中的應(yīng)用和推廣提供幫助。為了在一般實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到快速Feulgen 染色的目的，我們發(fā)現(xiàn)在60℃恒溫下，用磷酸水解宮頸涂片10 分鐘，DNA 硫堇染色液染色10 分鐘。結(jié)果表明，細(xì)胞核染色較深，結(jié)構(gòu)清晰，背景較淺，但染色時(shí)間由1 小時(shí)縮短到10 分鐘。這種快速Feulgen 染色對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高，通用培養(yǎng)箱能滿足要求。此外，磷酸溶液試劑可重復(fù)使用3-4 次，預(yù)熱時(shí)注意密封可重復(fù)使用15-20 次。但染色液不能重復(fù)使用，只能當(dāng)天配制使用。染色液的使用過程中還存在以下問題：配制時(shí)要避光；攪拌、過濾、染色盡量在同一溫度下進(jìn)行；否則，溶解染料會(huì)因溫度變化而沉淀，導(dǎo)致結(jié)晶，影響染色。

圖2 同一標(biāo)本各組染色直方圖及散點(diǎn)圖對(duì)比

在常規(guī)宮頸涂片、冰凍切片、組織印跡和快速石蠟切片的快速病理診斷過程中，當(dāng)僅憑病理組織和細(xì)胞形態(tài)難以判斷腫瘤是良惡性時(shí)，細(xì)胞DNA 含量和倍體分析可提供重要參考，這已經(jīng)被許多腫瘤研究所證實(shí)。病變細(xì)胞核DNA含量和DNA 倍體類型的測(cè)定，可以顯示病變細(xì)胞的增殖活性，有助于良惡性腫瘤的鑒別[5,6]。細(xì)胞核倍體的測(cè)定與分析對(duì)判斷腫瘤惡性程度、選擇治療方案、預(yù)測(cè)預(yù)后具有重要價(jià)值[7]，從而進(jìn)一步擴(kuò)大細(xì)胞DNA 檢測(cè)的應(yīng)用范圍?？焖貴eulgen 染色法與經(jīng)典Feulgen 染色法檢測(cè)細(xì)胞DNA 結(jié)果高度一致。因此，快速Feulgen 染色法在臨床疾病輔助診斷中具有時(shí)間短、穩(wěn)定性好、工作效率高等優(yōu)點(diǎn)，值得推廣應(yīng)用。