止嗽立效丸薄層鑒別條件的優化及滅菌方式對薄層鑒別的影響研究

郝津芳

(山西華康藥業股份有限公司，山西 運城 043100)

0 引言

止嗽立效丸品種出自《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第七冊，由麻黃(制)、苦杏仁(去皮炒)、石膏、甘草、葶藶子、罌粟殼、萊服子七味中藥組成，具有止嗽、定喘、祛痰作用，臨床主要用于風寒咳嗽，喘急氣促等癥[1]。藥品生產質量管理中，滅菌過程是必不可少的環節，如果所用的滅菌方法不當，會導致藥物的主要成分增加或損失，甚至影響藥物本身的藥理和藥效，使產品不合格。質量標準對保障產品質量也至關重要。本實驗依據2015 版藥典的要求對止嗽立效丸原標準項下的鑒別方法加以改進，建立鑒別甘草和麻黃兩味藥材的新方法[2-14]。并從薄層色譜圖上定性地比較未滅菌、流通蒸氣滅菌和鈷60 輻照滅菌三種樣本中的主要標志成分是否有變化，從而為止嗽立效丸主要藥材成分的定性鑒別及合適滅菌方法的選擇提供參考。

1 儀器與試劑

CBIO-UV6A 多功能暗箱式紫外分析儀，分析天平，HH-S6型電熱恒溫水浴鍋，展開缸，WGL-230B 電熱鼓風干燥箱，KQ-250B 型超聲清洗器(工作頻率40KHZ)、隔膜真空泵，硅膠G薄層板(由青島海洋化工有限公司生產和由青島勝海化工有限公司生產)，定性濾紙(濾速為中速)，點樣毛細管(規格為0.5×100mm)，茚三酮，磷鉬酸，濃氨溶液，鹽酸，甲醇，氯仿，正丁醇，冰醋酸，石油醚(沸點：30℃～60℃)，苯，乙酸乙酯，無水乙醇。

四個批次的未滅菌、鈷60 輻照滅菌、流通蒸氣滅菌止嗽立效丸細粉(批號分別為：Q201712120、Q201712104、Q201712131、Q201712132，均由山西華康藥業股份有限公司生產提供)，甘草對照藥材、麻黃對照藥材、甘草次酸對照品、鹽酸麻黃堿對照品(均由中國食品藥品檢定研究院提供)，止嗽立效丸缺甘草陰性樣品、止嗽立效丸缺麻黃陰性樣品(均由山西華康藥業股份有限公司生產提供)。

2 實驗方法與結果

2.1 止嗽立效丸中麻黃藥材薄層鑒別方法的建立

止嗽立效丸的原部版質量標準中建立了麻黃藥材的薄層鑒別方法，但供試品溶液的處理方法步驟多、時限長、操作繁瑣，因此本文對止嗽立效丸中麻黃藥材的鑒別方法進行了改進且進行了方法學驗證。

2.1.1 止嗽立效丸中麻黃藥材的薄層鑒別改進方法

取本品2 g，加三氯甲烷20 mL，加濃氨試液1 mL，攪拌，加熱回流1 小時，抽濾。濾液蒸干，殘渣用2 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸麻黃堿對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液，照薄層色譜法通則0502 (《中國藥典》2015 版)試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿-甲醇-濃氨試液(20：5：0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.3%茚三酮正丁醇醋酸溶液(95：5)，在105℃加熱約5 分鐘，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.1.2 麻黃薄層鑒別改進方法的方法學驗證

2.1.2.1 供試品溶液制備方法的優化

在試驗中考察了加熱回流、超聲、冷浸過夜三種供試品溶液的處理方法。均取止嗽立效丸細粉2 g，加入三氯甲烷20 mL，加濃氨試液1 mL，攪拌，分別加熱回流1 小時、超聲提取30 分鐘(工作頻率40 KHZ)，放冷，抽濾，濾液蒸干，殘渣用2 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；另一份冷浸過夜，濾過，濾液用鹽酸溶液(3 →10)調節pH 為1，振搖，分取酸水層，蒸干，殘渣用甲醇溶解，作為供試品溶液。以上述2.1.1 建立的薄層色譜條件進行點樣分析，結果見圖1。由圖1 可看出：用三種方法制備的供試液，斑點數相同，其分離鑒別效果相當，都能達到定性鑒別的要求，但原方法用時長(冷浸過夜)、步驟多(濾液用鹽酸溶液(3 →10)調節pH 為1，振搖，分取酸水層，蒸干)不利于實際操作，所以選用加熱回流的方法提取或超聲提取，但回流提取條件下，所提取成分的含量較高，因此本試驗選擇用加熱回流的方法提取。

圖1 供試品提取方法優化圖譜

2.1.2.2 展開溶劑的優化

展開劑選擇比例分別為20:5:0.5 和20:4:0.2 的三氯甲烷-甲醇-濃氨試液，結果見圖 2。由圖2 可以看出，使用展開溶劑三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(20：5：0.5)可以獲得比三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(20：4：0.2)更好的分離效果，因此本試驗確定以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(20：5：0.5)為展開劑。

圖2 麻黃展開溶劑的優化圖譜

2.1.2.3 最佳點樣量的考察

在實驗中考察了點樣量對薄層鑒別結果的影響，分別吸取加熱回流法制備的供試品溶液3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL和對照品溶液10 μL 點于同一硅膠G 薄層板上，以上述2.1.1建立的薄層色譜條件進行點樣分析，觀察比較顯色劑顯色后不同點樣量的供試品溶液斑點顏色的深淺及大小，結果見圖3。由圖3 可知：點樣量3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL 均可達到要求，3 μL、4 μL 點樣時，斑點顏色較淡，因此本實驗確定的點樣量為5 μL。

圖3 麻黃最佳點樣量考察圖譜

2.1.2.4 最佳展開距離的考察

實驗考察了展距分別為10 厘米、12 厘米、14 厘米時對鑒別的影響。觀察并比較在展開距離不同的情況下，在與對照品色譜相應的位置上供試品溶液和對照藥材溶液的顯色斑點的比移值以及分離效果，實驗結果見圖4。由圖4 可以看出：展距為10 厘米時，在與對照品色譜相應的位置上供試品溶液和對照藥材溶液的顯色斑點有合適的比移值，且與供試品溶液和對照藥材溶液中其他顯色的斑點展現出較好的分離效果。

圖4 麻黃最佳展開距離考察圖譜

2.1.2.5 陰性干擾試驗及陽性試驗

取止嗽立效丸缺麻黃陰性樣品2 g，同上述2.1.1 法中供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。取按上述2.1.1 法中制備的供試品溶液0.5 mL 和對照品溶液0.5 mL，混勻，作為陽性樣品溶液。按照2.1.1 法中確定的薄層色譜條件進行點樣分析，觀察并比較在色譜圖中，供試品溶液與陽性樣品溶液在與對照品色譜相應的位置上的斑點。陰性樣品色譜在與對照品色譜相應的位置上的斑點，實驗結果見圖 5。由圖5 可知：供試品溶液與陽性樣品溶液色譜圖中，在對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性樣品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，無相同顏色的斑點，說明陰性樣品無干擾。陽性樣品溶液色譜圖與對照品色譜相應位置上的斑點顏色比供試品溶液色譜圖與對照品色譜相應位置上的斑點顏色深，排除了陽性干擾。

圖5 麻黃陰性干擾試驗及陽性試驗考察圖譜

2.1.2.6 耐用性試驗

取上述制備好的供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液、陽性樣品溶液，在另一生產廠家的薄層G 板(青島勝海)上點樣，按上述方法進行分析。結果見圖6。由圖6 可以看出，供試品在不同廠家硅膠G板的分離效果一致，表現出良好的耐用性。

圖6 麻黃耐用性試驗

2.2 止嗽立效丸中甘草藥材薄層鑒別改進方法的建立

《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第七冊 “止嗽立效丸”的質量標準中也建立了甘草藥材的薄層鑒別方法，但其展開劑中含有毒性試劑-苯，因此本文也對止嗽立效丸中甘草藥材的鑒別方法進行了改進且進行了方法學驗證。

2.2.1 止嗽立效丸中甘草藥材的薄層鑒別方法

取本品1.5 g，加硅藻土1 g，研磨分散，加鹽酸1 mL 與氯仿20 mL，加熱回流1 小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液；另取甘草次酸加乙醇制成每1 mL含2 mg 的溶液，作為對照品溶液，照薄層色譜法通則0502(《中國藥典》2015 版)試驗，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一用硅膠G薄層板上，以石油醚(30-60℃)-甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(10：20：7：0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱約5 分鐘，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.2.2 甘草薄層鑒別改進方法的方法學驗證

2.2.2.1 展開溶劑的優化：甲苯代替苯

吸取上述2.2.1 制備的供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液，分別點于同一硅膠G 薄層板上，分別以石油醚(30～60℃)-苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5：10：3.5：0.25)和石油醚(30～60℃)- 甲苯- 乙酸乙酯- 冰醋酸(5：10：3.5：0.25)為展開劑，觀察比較對照品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液與3 種滅菌處理方式供試樣品溶液的斑點的顏色及位置關系。結果見圖7。由圖7 可以看出，以石油醚(30～60℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5：10：3.5：0.25)為展開劑時，所得的薄層圖譜顯示了更好的分離效果，且用兩種展開劑分別展開相同的距離，所得的薄層圖譜上甘草次酸的位置一致，比移值Rf 值基本一致。由于苯毒性較高，可以致癌，可通過皮膚和呼吸道進入人體，在人體內極其難降解，所以本實驗中將展開劑中的苯用甲苯替代，且替代后仍可獲得較好的分離效果。

圖7 展開溶劑的優化

2.2.2.2 最佳點樣量的考察

在實驗中考察了點樣量對薄層鑒別結果的影響，分別吸取供試品溶液3 μL、5 μL、8 μL、10 μL、12 μL 和對照品溶液10 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以上述2.2.1 建立的薄層色譜條件進行點樣分析，觀察比較顯色劑顯色后在與對照品色譜相應的位置上不同點樣量的供試品溶液的顏色斑點的顏色深淺及大小。結果見圖8。實驗結果顯示，5 μL 為最佳點樣量。點樣量為3 μL 時樣品色斑淺，點樣量為5 μL 時，樣品色斑剛好看清，所以薄層鑒別方法中選擇5 μL 為最佳點樣量。

圖8 甘草最佳點樣量考察圖譜

2.2.2.3 最佳展開距離的考察

實驗考察了展距分別為13 厘米、15 厘米、17 厘米時對鑒別的影響。觀察并比較在展開距離不同的情況下，在與對照品色譜相應的位置上供試品溶液和對照藥材溶液的顯色斑點的比移值以及分離效果，實驗結果見圖9。由圖9 可以看出展開距離為13 厘米時就可以獲得較好的分離效果，所以薄層鑒別方法中選擇13 厘米為最佳展開距離。

圖9 甘草最佳展開距離考察圖譜

2.2.2.4 陰性干擾試驗及陽性試驗

取止嗽立效丸缺麻黃陰性樣品2 g，同上述2.2.1 中供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。取按上述2.2.1 法中制備的供試品溶液0.5 mL 和對照品溶液0.5 mL，混勻，作為陽性樣品溶液。按照2.2.1 法中確定的薄層色譜條件進行點樣分析，觀察比較與對照品色譜相應的位置上供試品溶液、陽性樣品溶液、陰性樣品溶液的顏色斑點。實驗結果見圖 10。由圖10 可以看出供試品溶液與陽性樣品溶液色譜圖中，在對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性樣品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，無相同顏色的斑點，說明陰性樣品無干擾。陽性樣品溶液色譜圖與對照品色譜相應位置上的斑點顏色比供試品溶液色譜圖與對照品色譜相應位置上的斑點顏色深，排除了陽性干擾。

2.2.2.5 耐用性試驗

取上述制備好的供試品溶液、對照藥材溶液和對照品溶液，在另一生產廠家的薄層G 板(青島勝海)上點樣，按上述方法進行試驗。觀察并比較兩種生產廠家的硅膠G 薄層板上薄層色譜圖譜的重現性，評價所建立的甘草薄層色譜圖是否對不同廠家生產的硅膠G 薄層板都具有良好的耐用性。結果見圖11。由圖11 可以看出實驗中建立的薄層色譜可以在不同廠家生產的薄層板上重現，實驗中建立的甘草薄層色譜方法具有耐用性。

圖10 陰性干擾試驗及陽性試驗圖譜

2.3 不同滅菌方式對止嗽立效丸中麻黃、甘草薄層色譜的影響

取3 個批次(分別為：Q201712104、Q201712131、Q201712132)下經過三種不同滅菌方式處理的(未滅菌、60Co 輻照滅菌和流通蒸氣滅菌)止嗽立效丸，按照上述2.1.1 和2.2.1 建立的麻黃及甘草薄層鑒別方法進行分析，以考察不同滅菌方式對止嗽立效丸中麻黃、甘草薄層色譜的影響。實驗結果見下圖12、13。

圖11 耐用性試驗圖譜

圖12 不同滅菌方式下麻黃的薄層鑒別

圖13 不同滅菌方式下甘草的薄層鑒別

從圖12、13 中可知：3 個批次下經過三種不同滅菌方式處理的(未滅菌、60Co 輻照滅菌和蒸汽滅菌)止嗽立效丸藥粉制成的供試品溶液薄層色譜圖均顯示，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，即：未滅菌、60Co 輻照滅菌與蒸汽滅菌供試品溶液薄層色譜沒有明顯差異。說明60Co 輻照滅菌與蒸汽滅菌均不會影響止嗽立效丸的薄層鑒別。

3 結論與討論

3.1 對麻黃、甘草薄層色譜原鑒別方法進行了改進

3.1.1 麻黃鑒別項下供試品溶液的處理方法進行了改進

原方法為加冷浸過夜，濾過，濾液用鹽酸溶液(3 →10)調節pH 為1，振搖，分取酸水層，蒸干，殘渣用甲醇使溶解，作為試品溶液，現改為攪拌，水浴40℃加熱回流1 小時，放冷，抽濾。濾液蒸干，殘渣用2 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。簡化了實驗步驟，節省了時間，降低了成本，增加了穩定性。

3.1.2 對麻黃鑒別項下展開劑的比例進行了考察優化

將原標準中展開劑三氯甲烷-甲醇-濃氨試液的比例由20：4：0.2 換為20：5：0.5，在20：5：0.5 展開條件下，可獲得比20：4：0.2 更好的分離效果，因此本試驗確定以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(20：5：0.5)為展開劑。

3.1.3 甘草鑒別項下展開溶劑的優化

將甘草項下展開劑石油醚(30～60℃)-苯-乙酸乙酯-冰醋酸換為石油醚(30～60℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5：10：3.5：0.25)，發現以石油醚(30～60℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(5：10：3.5：0.25)為展開劑時，也可滿足薄層鑒別的要求，因此，可考慮將展開劑中的苯換為甲苯，減少實驗的毒性。

3.2 對改進的薄層色譜法進行了方法學驗證

對改進的麻黃項和甘草項鑒別方法進行了點樣量、展開距離、陰性空白、耐用性等方面考察。試驗結果顯示，改進方法可以用于止嗽立效丸中主要藥材麻黃和甘草的鑒別。

3.3 不同滅菌方式薄層色譜的鑒別與比較

采用改進的麻黃項和甘草項鑒別方法進行了不同批次下不同滅菌方式的麻黃和甘草的薄層色譜圖譜的鑒別與比較，結果顯示：不同滅菌方式的麻黃和甘草薄層色譜圖譜無明顯差異，說明改進的薄層鑒別方法可用于比較不同滅菌方式的止嗽立效丸，且滅菌方式對止嗽立效丸的薄層鑒別沒有影響。