免疫細胞相關PD-1/PD-L1通路在腫瘤治療中的研究進展

楊勇，朱家紅，于正璽

(貴陽護理職業學院，貴州 貴陽 550081)

0 引言

對免疫系統認識的增加和免疫調節技術的出現開創了腫瘤治療的新紀元，使免疫治療可以成為繼手術、放療、化療和靶向治療方法之后腫瘤治療相關領域最成功的療法之一[1]。目前，腫瘤免疫治療主要包括過繼細胞免疫治療、檢查點抑制劑和治療性癌癥疫苗。免疫檢查點分子包括程序性細胞死亡受體-1(PD-1)和細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)。與CTLA-4 抑制劑相比，檢查點阻斷啟動PD-1/程序性死亡受體配體-1(PD-L1)軸具有更高的療效和更少的副作用[2]，此外，PD-1/PD-L1 檢查點抑制劑在黑色素瘤和非小細胞肺癌等多種腫瘤患者中顯示出了持久的抗腫瘤效果和安全性[3]，這使得PD-1/PD-L1 抑制劑成為一種更有前景和更有效的抗癌治療方法。為了確保免疫系統在對外來抗原做出反應時不會傷害宿主，人類進化出了免疫檢查點蛋白和機制來快速停止免疫反應[4]。然而，在惡性腫瘤的發生發展過程中，可能存在多種免疫抑制機制，從而妨礙有效的抗腫瘤免疫[5]。PD-1 及其配體PD-L1 檢查點信號通路是一對負性免疫共刺激分子，許多研究表明，PD-1/PD-L1 信號通路參與了多種免疫細胞的抗腫瘤反應過程，在腫瘤免疫逃逸中起著關鍵作用。

1 PD-1/PD-L1 信號通路概述

1.1 PD-1 的結構與表達

PD-1 又稱CD279，是一種免疫抑制性受體，屬于免疫球蛋白超家族成員的I 型跨膜糖蛋白，其相對分子量為55000-60000,包括胞外氨基酸頭部、跨膜結構域、胞漿區氨基酸尾部。胞外區由一個IgV 樣結構域組成，含有多個重要的N 連接糖基化位點，該區域能夠與其配體結合，進而抑制免疫細胞的活化；其胞質尾區包含兩個酪氨酸殘基，即免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受體酪氨酸轉換基序(ITSM),其中ITIM 能夠恢復胞質段的磷酸化，發揮拮抗抗原受體信號的功能[6,7]。PD-1主要在外周的CD4+、CD8+T 細胞、NK 細胞、巨噬細胞、B 細胞表面、樹突狀細胞及部分腫瘤細胞系和腫瘤細胞表面廣泛表達。國外研究[8]顯示，PD-1 也表達于調節性T 細胞(Treg)，可以促進CD4+T 細胞分化為Treg 細胞，使Treg 細胞活性增強，在免疫調節過程中扮演重要角色。

1.2 PD-Ll 的結構與表達

PD-l 的配體PD-LI 又稱CD274，是由290 個氨基酸組成的I 型跨膜糖蛋白，定位于人類9p24 染色體，具有負向調節免疫應答的功能，主要由一個lgV 樣區、IgC 樣區、跨膜疏水區及30 個氨基酸構成的胞內區組成，其中IsV 樣區與IgC 樣區參與細胞間的信號轉導，胞內區則與細胞內的信號轉導有密切關聯[9]。PD-L1 不僅在活化的T 細胞、B 細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞等多種細胞中表達，同時也表達于其他多種組織細胞如血管上表皮細胞、肝臟、心臟、胰島細胞、多種間質細胞及胎盤組織中表達[10]。此外，該配體在許多癌癥中的表達能力較正常組織明顯調高[11]，例如非小細胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等，提示PD-L1 參與了腫瘤的發生發展，在抑制腫瘤免疫反應方面起著重要作用。研究發現[12], 干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-2、IL-10 等多種細胞因子可通過上調PD-L1 分子在不同組織細胞中表達。

2 免疫細胞相關PD-1/PD-L1 檢查點通路

2.1 T 細胞相關PD-1/PD-L1 檢查點通路

腫瘤微環境中的浸潤CD8 ＋T 細胞是細胞免疫的主要效應細胞，能夠分泌IFN-γ及穿孔素等細胞因子，直接殺傷腫瘤細胞。在腫瘤微環境的背景下，抗腫瘤T 細胞從腫瘤發生的初期到轉移灶的形成過程中，持續識別相關的腫瘤抗原。T 細胞抗原受體(TCR)的激活會導致促炎細胞因子的產生，其中的IFN-γ是刺激腫瘤細胞PD-L1 表達的最有力驅動因素[13,14]。此外，IFN-γ在微環境中的慢性表達也會導致浸潤的T 細胞上PD-1 的表達升高。腫瘤細胞上高表達的PD-L1 識別抗腫瘤T細胞上的PD-1 后，不僅抑制T 細胞免疫刺激因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)的分泌，而且促進免疫抑制細胞因子(IL-10)的分泌，從而使T 細胞的活化和增殖受到抑制[15]。最終，腫瘤細胞逃脫了免疫細胞的破壞而發生增殖和轉移。該機制一直被認為是腫瘤細胞發生免疫逃逸的相同途徑。類似也研究表明[16,17]，在受到腫瘤微環境中免疫抑制細胞及因子的作用后，活化的CD8＋T 細胞往往會轉化成為耗竭型T 細胞，其細胞膜表面高表達PD-1、CTLA-4 等免疫抑制分子，不僅喪失了分泌IFN-γ等效應因子的功能，而且還產生免疫抑制的作用。因此，運用 PD-1/PD-L1 抗體可以靶向阻斷 PD-1/PD-L1 信號通路來增強T 細胞的應答，以激活抗腫瘤免疫，調節臨床抗腫瘤活性[18]。

以往的研究觀點認為PD-L1 主要存在于腫瘤組織細胞的細胞膜上，因此我們推斷其對T 細胞的抑制作用也主要局限于腫瘤微環境中。而最新的研究[19]發現腫瘤細胞可以通過釋放表面富含PD-L1 的外泌體發揮對腫瘤殺傷性T 細胞的功能抑制作用，這項發現第一次證實PD-L1 不僅存在于腫瘤細胞的細胞膜上，還大量存在于腫瘤細胞釋放的外泌體膜表面，且其含量比腫瘤細胞膜表面的PD-L1 高得多。外泌體是由細胞分泌產生的直徑在50-120 nm 的一類細胞外囊泡，攜帶豐富的生物活性分子(如蛋白質、RNA 等)，并可通過自分泌或旁分泌方式參與對局部或遠處細胞的功能調控，影響細胞外微環境[20]。研究人員在轉移性惡性黑色素瘤患者及小鼠荷瘤動物模型中證實，腫瘤細胞分泌的富含PD-L1 的外泌體可進入機體并通過外周血對腫瘤微環境以外的T 細胞起抑制調控作用，且外周血中PD-L1 陽性外泌體的濃度水平與腫瘤大小有密切的正相關關系。此外，腫瘤細胞分泌的富含PD-L1 的外泌體還可進入機體外周循環系統，并與其中的T 細胞接觸同時抑制其功能，達到全面抑制T 細胞抗癌免疫的作用，從而將PD-1/PD-L1 信號通路介導的腫瘤免疫抑制作用拓展到了全身范圍內。本研究結果是對目前腫瘤免疫檢查點的抑制調控機制的重要補充，有助于研究者進一步了解腫瘤免疫逃逸的機制。

以樹突狀細胞(DC)為基礎的癌癥免疫治療是最重要的抗癌免疫療法之一，對不同的癌癥類型有不同的療效。DC 細胞上PD-L1 的表達與T 細胞上的PD-1 相互作用，導致DC 細胞向T 細胞呈遞腫瘤抗原后的抗腫瘤反應受到抑制。Hassannia等的研究結果表明[21]，DC 疫苗中PD-L1 的沉默可以影響其表型和功能特性，并增加T 細胞的激發潛能。此外，PD-1 沉默可以增強在PD-L1 沉默的DC 上識別腫瘤抗原后的T 細胞反應。這項發現表明PD-L1 沉默的DC 疫苗與負載PD-1 小干擾RNA 的納米粒聯合治療癌癥具有很高的效力。

2.2 NK 細胞相關PD-1/PD-L1 檢查點通路

NK 細胞是除T 細胞和B 細胞以外的第三類重要淋巴細胞，它通過釋放細胞因子和趨化因子調節機體免疫應答。不僅是免疫系統的第一道防線，而且由于其具有識別應激細胞分子模式的能力，也介導了抗實體瘤和血液腫瘤免疫反應。NK 細胞在一些異基因干細胞移植中具有較強的抗白血病細胞活性，并且它們在實體瘤中的存在也是一個很好的預后因子。與T 細胞的識別機制不同，NK 細胞的識別并不要求癌細胞表達新抗原或過度表達自身相關抗原，腫瘤細胞上組織相容性復合體表達的缺失增加了腫瘤對NK 細胞殺傷的敏感性，并且NK 細胞通常被在致癌應激時上調的配體激活[22]。

PD-1/PD-L1 通路抑制劑的最初設計原理主要是解除腫瘤微環境對T 淋巴細胞的耗竭，提高T 細胞的抗腫瘤效果。但在眾多的臨床試驗中，研究人員發現PD-1/PD-L1 通路同樣參與了NK 細胞介導的抗腫瘤免疫。在幾種癌癥適應癥中的NK 細胞上已經檢測到PD-1 的表達[23-25]。

目前發現在一些缺乏人類白細胞抗原-I 分子表達的腫瘤中，PD-1 拮抗劑仍有效；并且在一些腫瘤類型中觀察到了對PD-1 拮抗劑的強烈臨床反應。Benson DM Jr 等人[26]在一項針對多發性骨髓瘤的免疫治療研究中發現患者的外周血NK 細胞過表達PD-1，提示患者NK 細胞的腫瘤殺傷功能可能受到PD-1/PD-L1 通路的抑制。而在隨后的抗PD-1 抗體治療研究中發現，被PD-1 抗體封閉的NK 細胞顯示出更強的腫瘤細胞殺傷活性。這提示我們：在未來的研究中，確定導致腫瘤中NK細胞表達PD-1 的機制以及不同腫瘤中PD-1 表達差異的來源將是非常重要的。

關于PD-1 是否以及如何調節NK 細胞對腫瘤反應的分子機制研究尚不明確。以前的一些研究表明，抑制性受體破壞了NK 細胞的穩定性，使NK 細胞在成功發起溶細胞攻擊之前脫離了它的目標[27,28]。另外一項研究結果表明[29]，PD-1 的參與抑制了NK 細胞的細胞毒作用，阻斷了NK 細胞免疫突觸的裂解顆粒極化，同時伴有整合素“由外向內”信號的損傷。這些研究為PD-1 受體如何破壞NK 細胞功能提供了新的機制見解。

Hsu J 等人于2018 年9 月在國際醫學期刊《Journal of Clinical Investigation》上發表的文章[30]也闡明在小鼠腫瘤模型內PD-1/PD-L1 抑制通路對NK 細胞起到了抑制作用。該研究表明，即使在體外NK 細胞靶標較差的腫瘤中，也會出現NK 細胞表達PD-1 的情況。在表達NK 激活配體的RMA 轉染形成的腫瘤中，PD-1 的表達呈上升趨勢，但并不明顯。這些數據表明PD-1 的表達是由腫瘤內部提供的其他激活信號或激活信號的組合誘導的。這些研究提示我們可以將PD-1 或PD-L1 抗體治療與通過其他方式增強NK 細胞抗腫瘤效果的藥物聯合起來介導NK 細胞對癌癥的反應。另一項研究[31]結果分析證實，NK 細胞對于免疫檢查點抑制劑治療的效果的確起到了十分重要的影響。研究人員在對人以及小鼠體內的NK 細胞(腫瘤細胞為PD-L1 陰性)進行分析后發現，PD-L1 陽性的NK 細胞，在遇到對其易感的腫瘤細胞后，能夠成功被激活，并且分泌出更多的細胞因子和溶細胞顆粒，最終增強免疫療法的抗癌效果。通過體外研究證實，PD-L1 陽性的NK 細胞與PD-L1 陰性、或者是未接觸腫瘤細胞或細胞因子的NK 細胞相比，具有更強的殺滅腫瘤細胞的能力。這些發現同樣在動物模型的體內研究中得到了證實。不僅如此，這項研究還發現，PD-L1 陽性NK細胞的水平與癌癥患者的預后存在著明顯的相關。進一步研究結果證實，在免疫檢查點抑制劑的作用下，PD-L1 陽性的NK細胞的殺傷作用會變得更強，不僅能夠直接殺死腫瘤細胞，還能通過分泌的細胞因子控制腫瘤的生長。而在PD-L1 抗體的基礎上聯合NK 細胞活化因子，還能再一次顯著提高治療效果。最新研究結果也顯示[32]，PD-1 單抗聯合NK 細胞療法的治療效果是單純采用PD-1 單抗治療的近1 倍。實驗組患者在采用PD-1 單抗聯合NK 細胞治療后，腫瘤最大橫向直徑顯著縮短；另外，聯合治療后，NK 細胞的數量增加顯著且在整個試驗過程中治療耐受性良好，對癥治療后所有癥狀均緩解。這項研究結果表明，將抗PD-1 或抗PD-L1 抗體與NK 細胞聯合使用可增強抗腫瘤作用，為先前接受過PD-L1+晚期治療的非小細胞肺癌患者提供了全新的治療方案。Barry 等的研究[33]表明，NK細胞可通過DC 細胞增強PD-1 免疫療法的療效，這些先天細胞是增強T 細胞腫瘤反應所必需的，這表明腫瘤微環境中NK細胞和DC 細胞水平也可以作為預測PD-1 抗體藥物療效的生物標記物。

2.3 巨噬細胞相關PD-1/PD-L1 檢查點通路

腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)是指腫瘤微環境中浸潤的巨噬細胞，根據活化途徑和分泌的細胞因子及表型分成經典活化的M1 型和選擇性活化的M2 型巨噬細胞。M2 型TAMs 可以抑制腫瘤浸潤淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫，并分泌促腫瘤產物，因此被認為具有更重要的促腫瘤作用[34]。Chen 等[35]提出在腫瘤微環境中，TAMs 所產生的炎性細胞因子可通過NF-KB與STAT-3 信號通路促進PD-L1 的表達。而根據以往的研究，PD-L1 的表達可以誘導巨噬細胞向M1 表型轉變[36]。腫瘤可通過在微環境中產生IL-10 和巨噬細胞集落刺激因子，誘導TAMs 過度表達，從而阻礙正常抗原呈遞和腫瘤免疫反應[37]。此外，TAMs 分泌的表皮生長因子能夠降低上皮鈣黏著蛋白、B-連環蛋白的表達水平[38],使細胞黏附能力下降，從而促進腫瘤的侵襲、進展和擴散。

Gordon 等[34]的 研 究 表 明TAMs 表 達PD-1，提 示PD-1/PD-L1 信號通路可能通過直接作用于巨噬細胞而發揮作用。應用PD-1/PD-L1 抗體可以阻斷其抑制作用，恢復巨噬細胞抗癌活性。這項研究進一步提高了我們對阻斷PD-1 和PD-L1相互作用促進抗腫瘤免疫機制的了解。也有研究[39]顯示，晚期胃癌衍生的外泌體也可以有效誘導PD1+AMs 的產生，并且這些細胞可以產生大量的IL-10，從而抑制CD8+T 細胞免疫功能，為促進腫瘤生長創造條件。因此推測，可以通過聯合靶向PD1+TAMs 和腫瘤來源的外泌體的免疫治療方法來恢復腫瘤患者的免疫功能。

3 小結

腫瘤免疫治療和腫瘤微環境一直是研究的前沿，已取得了顯著進展，特別是針對免疫檢查點PD-1/PD-L1 治療惡性腫瘤的研究。然而，大多數腫瘤的低反應率仍然是一個挑戰。腫瘤微環境中多種成分之間相互作用、相互補充，其調控機制十分復雜。我們仍需推進對腫瘤微環境的研究，探索新的治療靶點。以往的PD-1/PD-L1 抑制劑主要針對T 細胞，而隨著對PD-1/PD-L1 檢查點調控機制認識的不斷加深，其他免疫細胞如NK細胞和巨噬細胞等的PD-1/PD-L1 信號通路的相關調控機制也不斷被發現。因此，基于PD-1/PD-L1 抑制劑的治療方案也越來越多，如PD-1/PD-L1 單抗聯合NK 細胞、PD-1/PD-L1 單抗與通過其他方式增強NK 細胞抗腫瘤效果的藥物聯合、PD-1/PD-L1 單抗聯合靶向腫瘤來源的外泌體的免疫治療等方案。這些研究成果有望為腫瘤的臨床治療開辟新的策略。