骨髓瘤診斷及預后評估的新標志物-胞外囊泡

劉曉莉 周林 韓崇旭

1大連醫科大學研究生院（遼寧大連116044）；2揚州大學附屬蘇北人民醫院醫學檢驗科（江蘇揚州225001）

骨髓瘤，又稱多發性骨髓瘤（multiple myelo?ma，MM），是以骨髓中克隆性漿細胞增殖紊亂為特點的惡性血液系統疾病，在血液系統腫瘤中發病率排名第二［1-2］。隨著國內人口的老齡化，該病的發生率也逐年上升。目前，MM是通過骨髓中克隆性漿細胞的數量、M蛋白的濃度水平以及相應的臨床癥狀（高鈣血癥、腎損傷、骨質破壞和貧血）進行診斷，患者一旦被確診為MM，均已出現不同程度的器官損傷，嚴重影響患者的預后［3］；此外，難治、易復發使MM至今仍成為不可治愈的血液系統疾病［4］。因此MM的早期診斷和預后監測對MM患者的生存就顯得尤為重要。胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是細胞分泌的一種膜性囊泡［5］，其內容物中含有豐富的蛋白質、非編碼RNA（non?coding RNA，ncRNA）、脂質、細胞因子、酶等具有生物學活性的分子，這些分子的存在可在一定程度上反映其所來源的細胞特性［6］。當骨髓微環境中的EVs與克隆性漿細胞相互作用時，克隆性漿細胞通過對EVs的識別、內化等過程誘導自身的增殖分化［7］，表明EVs在MM的發生、發展中扮演著重要的角色。

1 胞外囊泡的生物學特性

EVs現有的分類主要依賴于囊泡體積大小和生物學發生機制［8］。最新的研究表明，EVs的兩個主要類別是囊泡體和外泌體，囊泡體主要包括微粒和微囊泡，其發生機制目前認為是細胞通過質膜直接出芽釋放而來，大小范圍為50 nm至1mm；而外泌體的發生機制則更為復雜，其是細胞通過胞吞作用后，在胞質內經過早期分選內體、晚期分選內體最終形成包含有多個管腔內囊泡（intralu?minal vesicle，ILVs）的多泡體，當多泡體與質膜發生融合后，通過胞吐作用將ILVs釋放到細胞外，釋放到細胞外的ILVs被稱為外泌體，直徑約為30～160 nm［9］。

由于EVs在細胞外環境中的廣泛存在，且依靠其獨特的脂質雙分子膜結構、納米級的體積以及內容物中含有的豐富的生物活性物質，因此，EVs具有發揮調控細胞間生物學作用的獨特優勢。現有的研究表明，EVs可分別通過下述三種不同的途徑來調控受體細胞：（1）可通過吞噬和胞飲作用被受體細胞特異性攝取；（2）可通過受體?配體作用被受體細胞捕獲；（3）可通過與受體細胞質膜之間的直接融合；當EVs被靶細胞內化后，EVs中的內容物會通過溶酶體逃逸的間接途徑被轉運到胞核或胞膜，從而發揮調控受體細胞的生物學功能的作用［10-11］。EVs的這一特性，在腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用［12］。

2 胞外囊泡對多發性骨髓瘤發生、發展的影響

最新的研究表明，骨髓瘤細胞衍生的EVs能被骨髓瘤微環境中的特定細胞攝取［如NK細胞、髓源抑制性細胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）、骨髓間充質干細胞（bone marrow?derived mesenchymal stem cells，BMSCs）、內皮細胞、成骨細胞和破骨細胞等］，并改變上述細胞的生物學特性，形成有利于骨髓瘤細胞增殖、分化的骨髓微環境，從而對MM患者產生局部或全身性的影響，與此同時，骨髓中各類基質細胞衍生的EVs被骨髓瘤細胞攝取后，能夠促進骨髓瘤細胞發生遠處轉移、加劇骨質破壞、藥物耐受等［13］，最終導致骨髓瘤患者的進展。

2.1 胞外囊泡促進骨髓瘤患者的免疫抑制MM患者骨髓中各類細胞來源的EVs對機體發揮著負向免疫調節的作用，促進了疾病的進展。文獻報道，MM患者的BMSCs來源的EVs可誘導外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中CD3+和CD4+淋巴細胞凋亡，促進具有負向免疫調節作用的調節性T細胞的分化、增殖，引起具有免疫抑制作用的炎性因子IL?10的濃度升高，從而加劇了MM患者的免疫抑制，促進了骨髓瘤細胞的免疫逃逸［14］；同樣，WANG等［15］在荷瘤小鼠模型中的研究發現，BMSCs來源的EVs，通過活化MDSCs的STAT3、STAT1等信號通路，促進了MD?SCs的增殖和活化，并通過上調抗凋亡蛋白Bcl?xL和Mcl?1的表達，抑制MDSCs的凋亡，促進了MD?SCs細胞的免疫抑制功能，從而加速MM的進展。

2.2 胞外囊泡促進骨髓瘤遠處轉移、骨質破壞及治療耐受在缺氧環境下，骨髓瘤細胞釋放的高表達miR?135b的EVs，被內皮細胞內化后，可下調低氧誘導因子抑制因子（factor?inhibiting hypoxia inducible factor1，FIH?1），并通過HIF?FIH信號通路增加內皮血管的形成，促進了MM的遠處轉移［16］；此外，EVs還可以加劇上皮間質轉化，促進MM的轉移與擴散［17］。骨髓瘤細胞來源的外泌體中含有具有生物活性的lncRNARUNX2?AS1，并可以傳遞給間充質干細胞（mesenchymal stromal cells，MSCs），在MSCs中lncRNARUNX2?AS1與pre?RUNX2形成RNA雙鏈，阻止mRNA的剪切，并以一種負反饋的方式調節RUNX2 mRNA和蛋白表達，降低MSCs向成骨細胞轉化，從而抑制骨的生成［18］；FAICT等［19］從5TGM1小鼠骨髓瘤模型的研究中發現，骨髓瘤細胞來源的EVs可調節成骨細胞活性與功能，抑制成骨細胞分化。此外，EVs還參與了MM耐藥性的產生。ZHANG等［20］研究表明，MM患者硼替佐米的耐藥性的產生可能與外泌體中的miR?16?5p、miR?15a?5p和miR?20a?5p、miR?17?5p的下調有關。總之，EVs通過促血管生成、抑制骨合成、調控治療耐受等途徑，促進了MM的發生、發展。

3 胞外囊泡作為新型液體活檢標志物在骨髓瘤早期診斷和預后評估中的研究進展

細胞主要通過運輸所需的內體分選復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）依賴或ESCRT非依賴途徑調控不同類型EVs的釋放以及其內容物分子的分選和裝配，從而導致EVs既具有與來源細胞的同源性，同時也具備有別于來源細胞的獨特性，因此，EVs作為疾病診斷和預后評估的新型液體活檢標志物備受關注［21］。在實體腫瘤領域，已有相關的研究表明特異性EVs群在胰腺癌、肺癌等疾病的診斷和預后評估中有重要的價值［22-23］。而在血液系統腫瘤的研究中，EVs在B細胞惡性腫瘤中已經取得一定的研究進展［24］。骨髓瘤患者的臨床表現較為多樣化［25］，在臨床診療中很容易出現誤診和漏診，且現有的有創診斷方式會給患者帶來巨大的痛苦，因此更加需要發現具有特異性的、能夠反映骨髓中克隆性漿細胞增殖情況的新型標志物來解決上述問題。

3.1 胞外囊泡作為骨髓瘤患者早期診斷的新型液體活檢標志物研究發現，與健康對照組相比，MM患者外周血中的總的EVs，尤其是CD138+EVs的數量顯著升高，提示CD138+EVs可作為MM診斷的一個新的實驗室指標，且該群EVs數量較血清M蛋白能夠更為敏感地反映患者的治療效果及復發監測［26］。也有研究發現，MM細胞釋放的外泌體可表達腫瘤B細胞的免疫球蛋白B細胞受體（Ig?BCR），其可以被獨特型結合肽（Id?peptide）靶向結合，研究者使用5T33MM細胞表達的Ig?BCR作為誘餌，通過篩選噬菌體展示文庫來選擇Id肽，篩選出p5肽作為特異性肽結合物，結果證明利用獨特型結合肽檢測血清中MM細胞來源的外泌體比傳統的M蛋白檢測能更早的發現MM細胞的存在，提示p5肽陽性的外泌體可作為MM患者的早期診斷新型生物標志物［27］。除了上述具有獨特表型的EVs在MM的早期診斷中具有重要作用以外，EVs內容物中的非編碼RNA（ncRNA）及某些具有特定功能的蛋白質也對MM早期診斷具有提示作用。在ncRNA領域，目前研究最多的為MicroRNA、lncRNA等，研究顯示，外泌體中的miR?21、miR?164a的表達水平在MM的診斷中也有重要的作用［28］。SEDLARIKOVA等［29］研究發現，外周血外泌體中的lncRNAPRIN對MM及意義未名的單克隆丙種球蛋白血癥（monoclonal gammopathy of un?determined significance，MGUS）的診斷敏感性和特異性分別為84.9%、83.3%，其中PRINS對MGUS具有更高的診斷效能，提示血清外泌體中的lncRNA PRINS可成為MGUS輔助診斷的新的實驗室指標。此外，在對EVs內容物進行蛋白質組學的研究中，研究者發現MM患者外泌體中含有高表達的酪氨酸蛋白激酶（c?src），而在正常人及MGUS患者的外泌體中卻未見該蛋白的表達，提示外泌體中的c?src不僅可用于MM診斷，更可作為MGUS與MM患者鑒別診斷的高特異性的新型標志物［30］。EVs作為新型的液體活體標志物與傳統的MM診斷手段相比，能夠更早期、更特異的輔助診斷MM，且通過外周血樣本的檢測就能實現，減少患者行骨髓穿刺手術的痛苦。

3.2 胞外囊泡作為骨髓瘤患者預后評估的新型液體活檢標志物一般情況下，影響骨髓瘤患者預后的因素，主要包括宿主因素、腫瘤特征和治療方式［31］，目前，對于EVs的研究更多的集中在腫瘤特征這一方面。MANIER等［32］分析了156例新診斷的MM患者，發現MM患者外周血外泌體中的22個miRNA水平顯著低于健康者，其中let?7b、let?7e、miR?106a、miR?106b、miR?155、miR?16、miR?17、miR?18a和miR?20a被確定為無進展生存的重要預測指標，而let?7b和miR?18a是總生存率重要的預測因子，且let?7b或miR?18a的低表達與ISS高的分期顯著相關。ZHANG等［33］研究也證明，在ISS分期中，Ⅰ期患者let?7d?5p和miR?425a?5p的表達水平明顯高于Ⅱ期和Ⅲ期患者；與腎臟未損傷的患者相比較，發生腎損傷患者的let?7c?5p，let?7d?5p 5p，miR?140?3p，miR?185?5p和miR?425?5p降低；具有高水平的IL?6患者顯示出let?7c?5p，miR?140?3p，miR?185?5p和miR?425?5p的低表達，這些結果表明，外泌體miRNA表達的下降可能與骨髓瘤臨床癥狀的發展和疾病的進展有關。lnc00461在MM細胞及MSCs中高表達，MSCs通過外泌體向MM細胞傳遞lnc00461，抑制MM細胞中的miR?15a和miR?16的表達，從而上調了MM細胞的BCL?2的表達，促進MM細胞的增殖，抑制其凋亡；研究結果還證實MSCs來源的外泌體中的lnc00461與MM患者的生存率及預后密切相關，與lnc00461低表達組相比，高表達組患者有較差的生存結果的表現［34］。XU等［35］研究也發現，lncPSMA3?AS1和PSMA3在硼替佐米耐藥的MSCs來源的外泌體中表達增加，通過檢測外泌體中lncPSMA3?AS1和PSMA3可評估應用硼替佐米治療后對疾病的改善情況，提示循環外泌體中的lncPSMA3?AS1和PS?MA3有望成為除國際分期系統外的一種新型預后分層指標。還有研究發現piRNA823主要在MM患者外周血的EVs及MM細胞衍生的EVs中富積，發現piRNA?823在ISS分期中II期和III期患者的外周血中顯著增加；血清EVs中piRNA?823的增加與傳統標志物β2?MG（r=0.800，P<0.01）呈正相關，提示EVs中的piRNA823可作為一個新型的預后監測指標［36］。

在蛋白質分析領域，通過蛋白質組學評估發現EVs中的各類蛋白與MM患者預后的相關性。HARSHMAN等［37］研究發現，CD44在皮質類固醇抵抗性MM.1R細胞系的EVs組分中特別富集，同時其在MM患者血清來源的EVs中高表達，且CD44的高表達與MM患者的總體生存率呈負相關，提示CD44也是一種MM患者的預后監測指標。近年來的相關研究表明，EVs不僅可作為MM早期診斷標志物，在患者的分期、生存預測中也具有重要意義。基于EVs獨特的生物學特性，使用EVs作為診斷后預后評估的生物標志物具有明顯優勢，其可通過外周血直接被檢測，可重復性高，給患者帶來的痛苦較小，且與傳統實驗室診斷方法相比，能夠更為特異性的反映骨髓中克隆性漿細胞的增殖情況。

4 總結與展望

截止目前，有關EVs在MM中的研究，仍較多的集中在以細胞、動物模型為平臺的基礎機制研究方面，而應用EVs作為MM患者診斷及預后監測的新型液體活檢標志物的臨床研究則較為少見。究其原因，主要是由于EVs的分離方法眾多且難以做到標準化，不同分析方法分析結果的一致性、再現性較差。有文獻報道，研究者們使用不同的分離方法會導致EVs及其RNA的濃度、純度或大小存在差異［38］。除此之外，在使用EVs相關的內容物（如DNA、RNA、蛋白質等）作為標志物研究時，應盡可能的選擇純度較高的提取EVs的方法，且由于患者血清或血漿中存在多種的可溶性蛋白或游離DNA或RNA，這些蛋白或DNA、RNA可能會對研究結果產生正向或負向的影響，因此在實驗過程中應盡可能證明被研究的標志物是來自EVs，以免造成研究者得出錯誤的結論［39］。上述原因也成為了研究者們開展針對特異性EVs或EVs中的特異性表達的內容物的臨床研究難以逾越的障礙。

此外，EVs至今未應用于MM的臨床診斷和預后評估，其中最為重要的原因在于，研究者們還沒有能夠通過實驗研究，在外周血中找到與骨髓中克隆性漿細胞呈高特異性相關的胞外囊泡群，不過隨著EVs分離純化方法標準化、各種更為先進的檢測技術的不斷涌現，特異性EVs終將會成為一個MM診斷和預后評估的新型液體活檢標志物。