基于網絡藥理學探討麻黃附子細辛湯治療兒童哮喘的作用機制研究

付宇 鄧娜 田書芳

摘要 目的：利用網絡藥理學的方法預測麻黃附子細辛湯治療兒童哮喘的活性成分，并預測其作用靶點，探討其可能的作用機制。方法：用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）和GeneCards數(shù)據(jù)庫收集麻黃附子細辛湯的活性成分及靶點，采用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構建藥物-活性成分-靶點的網絡和作用于哮喘的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，通過ClusterProfiler語言包進行GO和KEGG通路的富集分析。結果：通過口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18篩選得到35個有效活性成分，包括槲皮素、木犀草素、（+）-兒茶素等，收集了171個靶點，包括JUN、AKT1、MAPK1、MAPK3、RELA和IL6等，并富集得到多條GO功能和KEGG通路，比如TNF信號通路，AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路等。結論：麻黃附子細辛湯可能通過抑制炎癥介質的表達，促進氣管重塑，改善氣管堵塞等而發(fā)揮治療兒童哮喘的作用。

關鍵詞 麻黃附子細辛湯;兒童哮喘;網絡藥理學;作用機制

Abstract Objective：To predict the active chemicals and targets on childhood asthma and explore the mechanism of Mahuang Fuzi Xixin decoction.Methods：Based on TCMSP and Genecards database，the active chemicals and chemicals-targets were gathered.Then drug-chemicals-targets network and PPI network were performed utilizing string database and Cytoscape software.Finally，GO and KEGG enrichment analysis were carried out by using Cluster Profiler package in R RStudio software.Results：With the setting of OB≥30% and DL≥0.18，35 active chemicals were gathered，including quercetin，luteolin，（+）-catechin and so on and 171 targets（JUN，AKT1，MAPK1，MAPK3，RELA，IL6，etc）were fished out.GO and KEGG pathways were gathered and analysed，including TNF signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway，IL-17 signaling pathway，HIF-1 signaling pathway and so on.Conclusion：Mahuang Fuzi Xixin Decoction may play a role in treating childhood asthma，inhibiting the expression of inflammatory factors and improving tracheal obstruction，through regulating multiple components，multiple targets，multiple signaling pathways.

Keywords Mahuang Fuzi Xixin Decoction; Childhood asthma; Network Pharmacology; Mechanism

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.005

哮喘被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為四大頑疾之一，而在我國哮喘死亡率明顯高于其他國家，且有1/3的哮喘患者是兒童[1]。兒童哮喘即兒童支氣管哮喘，是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣道炎癥，常伴有喘息、氣促、胸悶和咳嗽等癥狀，嚴重影響了兒童的生長發(fā)育與身心健康[2-3]。麻黃附子細辛湯源自《傷寒論》，由麻黃（MH）、附子（FZ）和細辛（XX）三味中藥組成，具有助陽解表之功效，用于治療太陽少陰兩感疾病，比如帶狀皰疹，偏頭痛，喑啞等[4-7]。隨著現(xiàn)代社會快速發(fā)展，麻黃附子細辛湯的應用范圍越來越廣泛，研究發(fā)現(xiàn)該藥對兒童哮喘有一定的治療效果，但是其作用機制尚不清楚[8-9]。中藥復方成分復雜，機制不清，闡明其作用機制是亟待解決的難題，而網絡藥理學是結合藥理學和藥效學的一個新興領域，具有整體性和系統(tǒng)性的特點，這與中醫(yī)基于辨證論治、協(xié)同作用的總體思路相吻合[10-12]。它可以解釋中藥的活性化學成分和靶點，闡明其作用機制，預測新的并發(fā)癥，并發(fā)現(xiàn)藥物的綜合作用。因此，本研究利用網絡藥理學的方法探討麻黃附子細辛湯治療兒童哮喘的作用機制，為麻黃附子細辛湯的進一步研究提供參考。見圖1。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點的收集 選用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org），UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），STRING數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/），Cystoscope3.7.2軟件。分別以麻黃、附子、細辛為關鍵詞，從TCMSP軟件（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中逐一獲取麻黃附子細辛湯中三味中藥的所有化學成分。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，從而得到活性成分。活性成分的作用靶點從TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得，把靶點名稱輸入UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），獲得其相應靶點的人源靶點基因名稱。以“Childhood Asthma”為檢索詞，利用GeneCards（https：//www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫，設定物種為“Homo Sapiens”，檢索哮喘潛在靶點信息。將獲得的靶點名稱輸入到UniProt數(shù)據(jù)庫中得到靶點的基因名稱（Gene Name）。利用韋恩在線繪制工具，將活性成分的靶點與疾病的靶點進行匹配，交集部分為麻黃附子細辛湯作用于兒童哮喘的潛在靶點。

1.2 網絡圖的構建 將活性成分與對應靶點信息導入Cystoscape3.7.2軟件，構建活性成分與靶點的可視化網絡圖。將交集部分的靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中，設定物種為“Homo Sapiens”，設置最高置信度值為0.9，并隱藏離散的靶點，構建蛋白互作網絡圖。

1.3 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析 設定P<0.001，利用RStudio中ClusterProfiler包進行GO富集分析和KEGG代謝通路分析。先將基因名稱轉化為“ENTREZ ID”，選擇OrgDb為“org.Hs.eg.db”，進行GO和KEGG富集分析[13]。

2 結果

2.1 活性成分的篩選 從363個麻黃成分中篩選出23個活性成分，從65個附子成分中篩選出21個活性成分，從192個細辛成分中篩選出8個活性成分。刪除1個重復化合物，去除與疾病靶點無相關的化合物，最終得到35個活性成分，其中，麻黃成分22個，附子成分6個，細辛成分7個。見表1。

2.2 收集的靶點 從TCMSP中獲得3 919個麻黃靶點，139個附子靶點，1 668個細辛靶點，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中共獲得兒童哮喘有關靶點4 096個，刪除重復的靶點以及非人類的靶點共獲得216個成分靶點，最終得到171個活性成分作用于哮喘的靶點。見圖2。其中，PTGS1、ESR1、PTGS2、ACHE、PRSS1、NCOA2、PGR、ADRA1B、SCN5A、ADRB2、NCOA1等11個靶點為麻黃、附子、細辛共有;NR3C2和CHEK1為麻黃和附子共有靶點;AR、PPARG、CHRM2、NOS2、CHRM1、SLC6A2、F7、RELA、IKBKB、AKT1、BCL2、BAX、TNFSF15、JUN、CASP3、MAPK8、MMP1、STAT1、HMOX1、CYP3A4、CYP1A2、CYP1A1、ICAM1、SELE、VCAM1、NR1I2、CYP1B1、ALOX5、HAS2、GSTP1、AHR、PSMD3、INSR、GSTM1、AKR1C3、SLPI、CCND1、IL10、NOS3、CHRM3、CHRM4、SLC6A4、OPRM1、UGT1A1、ESR2等45個靶點為麻黃細辛共有。說明麻黃附子細辛湯不同的成分，通過相通的靶點，進而起到協(xié)同治療哮喘的作用，配伍具有一定的科學性。

2.3 網絡圖分析 通過Cystoscape3.7.2軟件，繪制了活性成分與靶點的可視化網絡圖。見圖3。活性成分的平均度值是6，其中Quercetin（槲皮素）、Luteolin（木犀草素）、Kaempferol、Naringenin（柚皮素）、Stigmasterol和Beta-Sitosterol的度值最高，分別為115、47、45、24、24和24，因此這6個成分是與兒童哮喘相關性最大的成分。

將交集靶點輸入到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫中構建蛋白互作網絡。設定物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閥值設為高置信度0.7，其余參數(shù)保持默認，獲得蛋白互作關系（圖4），并導出蛋白相互作用關系（string_interactions）的TSV格式數(shù)據(jù)文件。并通過R程序，統(tǒng)計頻次前20靶點，并繪制條形圖（圖5）。結果顯示，蛋白互作頻次較高的有JUN、AKT1、MAPK1、MAPK3、RELA、IL6等，表明此6個靶點在治療兒童哮喘中發(fā)揮主要作用。

2.4 GO和KEGG富集分析 生物過程主要富集在對有毒物質的應答反應，對細胞外刺激的反應，對氧化應激的反應以及對營養(yǎng)水平的反應等;分子功能主要富集在蛋白質異二聚活性，輔因子結合，近端啟動子序列特異性DNA結合，細胞因子受體結合以及受體調節(jié)活性等;細胞組分主要富集在膜筏、膜微區(qū)以及膜區(qū)等。從KEGG通路分析可以看出，麻黃附子細辛湯可以調控PI3K-AKT信號通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、內分泌抵抗、松弛素信號通路、Toll樣受體信號通路、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑、T細胞受體信號通路、NF-κB信號通路等多條通路。見圖6。

3 討論

兒童支氣管哮喘是一種慢性氣管炎癥性疾病，氣道呈現(xiàn)高反應狀態(tài)，與平滑肌功能障礙以及氣道炎癥均有關[14]。中醫(yī)認為，兒童支氣管哮喘病因為痰，誘因為外邪，痰隨氣升，氣因痰阻，壅塞氣道不利通暢，肺失宣降。在治療上，采用辨證論治。寒痰伏肺患者以溫肺散寒、化痰平喘為主;熱哮患者以清熱宣肺、化痰定喘為主;緩解期患者則是以脾、肺、腎論治。麻黃細辛附子湯中麻黃發(fā)汗散寒、宣肺平喘;附子回陽救逆、補火助陽、散寒止痛;細辛解表散寒、溫肺化飲。現(xiàn)代研究表明，該復方可抑制嗜酸性粒細胞、肥大細胞等的炎癥介質的釋放，降低血管通透性，具有抗變態(tài)反應作用;并能誘導T淋巴細胞的凋亡，使患兒哮喘變應性炎癥得到緩解。

本研究通過網絡藥理學的方法，對麻黃附子細辛湯治療兒童哮喘的作用機制進行了分析。通過活性成分與疾病靶點分析可知：麻黃附子細辛湯中共35個活性成分與哮喘有關，包括Quercetin（槲皮素）、Luteolin（木犀草素）、Kaempferol、Naringenin（柚皮素）、Stigmasterol和Beta-Sitosterol及兒茶素、Sesamin（芝麻素）等。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以降低IL-4、IL-5和Mir-155等炎癥介質，從而改善哮喘小鼠的氣道炎癥，且隨著槲皮素濃度增加，改善效果越明顯[15];槲皮素還能抑制BALF及血清炎癥介質水平的升高，降低肺組織中NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達，從而緩解卵清蛋白致小鼠支氣管哮喘的癥狀[16]。木犀草素可抑制大鼠p38MAPK蛋白表達，促進PPARγ蛋白表達而抑制哮喘大鼠的氣道炎癥[17]。木犀草素可以降低哮喘小鼠血清MDA含量、下調肺組織COX-2、PGE2、TNF-α及IL-1β的mRNA和蛋白表達，并具有抗氧化應激的作用，從而減輕哮喘小鼠氣道炎癥[18]。對雞卵清蛋白（OVA）致敏和激發(fā)的過敏性哮喘小鼠給予兒茶素后，發(fā)現(xiàn)外周血白細胞總數(shù)減少，肺組織中TSLP以及Th2型炎癥介質IL-5、IL-13的含量均減少，核因子κB P65核轉錄被抑制，從而緩解過敏性哮喘小鼠的炎癥反應[19]。柚皮素可以抑制人氣道上皮細胞的下游因子PI3K、PKB、p-PKB及核因子κB蛋白的表達而改善炎癥性氣道黏液高分泌的情況[20]。芝麻素是細辛中的成分，研究發(fā)現(xiàn)，與哮喘組小鼠比較，芝麻素可以降低炎癥細胞計數(shù)，降低IL-4、IL-5、IL-13水平，提高IFN-γ的表達，抑制IκBα磷酸化和核因子κB激活，而改善哮喘的炎癥反應[21]。

麻黃附子細辛湯中35個活性成分的作用靶點中，與哮喘相關的共171個，其中JUN、AKT1、MAPK1、MAPK3、RELA和IL6等靶點的度值最高，可能在麻黃附子細辛湯中發(fā)揮重要作用。AKT1是一種激酶，可以調節(jié)代謝，增殖，細胞成活，生長和血管生成，哮喘大鼠接觸過敏原后，肺組織中PTEN mRNA表達量降低，AKT1mRNA表達量升高，說明AKT1的過度表達可加劇哮喘癥狀[22]。Yang等[23]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患兒的MAPK1甲基化水平低于非哮喘患兒，控制MAPK1甲基化可有效改善哮喘;趙振營[24]研究發(fā)現(xiàn)MAPK3參與了哮喘患者的炎癥信號傳導、氣道平滑肌細胞凋亡的調節(jié);李海銀[25]發(fā)現(xiàn)RelA可參與調節(jié)中性粒細胞哮喘的中性粒細胞凋亡。丁召磊等[26]發(fā)現(xiàn)哮喘動物氣道中IL6明顯增加。綜上所述，麻黃附子細辛湯可能通過調節(jié)相關基因的表達，以緩解氣道炎癥和氣道阻塞等，從而發(fā)揮緩解哮喘癥狀的作用。

根據(jù)KEGG和GO富集分析結果可知，麻黃附子細辛湯可能是通過PI3K-AKT信號通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路以及酪氨酸激酶抑制劑等，完成有毒物質的應答、氧化應激反應等生物過程以及分子功能和細胞組分等的調節(jié)，從而發(fā)揮治療或預防哮喘的作用。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制PI3K/AKT信號通路，可減緩氣道炎癥反應，減低氣道的高反應性，從而緩解氣道重塑達到哮喘治療的效果[27-28]。酪氨酸激酶抑制劑能夠減輕慢性哮喘小鼠氣道重塑的程度，對哮喘氣道重構具有一定的防治意義[29-30]。TNF信號通路，可上調相關基因及趨化因子，從而導致哮喘的炎癥和免疫反應加重[31]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法探討了麻黃附子細辛湯在哮喘治療方面的作用機制，獲得了麻黃附子細辛湯治療哮喘的潛在成分、靶點以及信號通路等，為該方在哮喘治療方面提供了研究思路。但由于網絡信息技術的延時性以及藥物的復雜性，后續(xù)將對活性成分及靶點進行藥理學驗證，以明確麻黃附子細辛湯治療兒童哮喘的作用機制，以便更好地應用于臨床。

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（2020-12-03收稿 責任編輯：魏慶雙）