兩種紫蘇揮發(fā)油體外抑菌效果評價

褚宏葉　楊仕梅　商志偉　溫賀　趙德剛　沈奇

摘 要：紫蘇揮發(fā)油廣泛用于食品及醫(yī)藥行業(yè)。為了探究紫蘇醛及紫蘇烯兩種化學(xué)型紫蘇揮發(fā)油的抑菌活性，本研究采用水蒸氣蒸餾法對紫蘇葉揮發(fā)油進(jìn)行提取，采用GC-MS對揮發(fā)油成分進(jìn)行鑒定，并采用濾紙片法進(jìn)行體外抑菌活性評價。結(jié)果表明，供試兩種紫蘇揮發(fā)油分別含有59.71 mg/mL紫蘇醛及42.25 mg/mL紫蘇烯。抑菌試驗顯示兩種紫蘇揮發(fā)油均對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌三類細(xì)菌均有明顯的抑制活性。尤其是對沙門氏菌抑制作用，可達(dá)到和對照抗生素相似的效果，低濃度即可達(dá)到良好抑制效果。研究結(jié)果表明，兩種紫蘇揮發(fā)油有具有良好的抑菌效果，可作為天然的抑菌劑進(jìn)行應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：紫蘇;揮發(fā)油;抑菌活性

中圖分類號：R285.5? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2021）05-0034-06? ? 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.05.006

Evaluation of the Antibacterial Effect of Two Perilla Essential Oil in Vitro

CHU Hongye1，2，3，YANG Shimei1，SHANG Zhiwei3，WEN He3，ZHAO Degang1，3，SHEN Qi1，2*

（1.College of Life Sciences，Guizhou University/Agricultural Bioengineering Research Institute/Key Laboratory of Mountain Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation，Ministry of Education/Key Laboratory of Agricultural Bioengineering of Guizhou Province，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.Guangzhou Universityof Chinese Traditional Medicine，Institute of Physiology and Ecology of Medicinal Plants，College of Chinese Materia Medica，Guangzhou，Guangdong 510006，China;3.Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang，Guizhou 550008，China）

Abstract：Perilla volatile oil is widely used in the food and pharmaceutical industries.In order to explore the antibacterial activity of volatile oil of two chemical type，sperilla aldehyde and perillene，in this study，steam distillation was used to extract the volatile oil from perilla leaves，andgas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） was used to identify the chemical components of volatile oil，and then the filter paper method was used to evaluate the antibacterial activity in vitro.The results showed that the two Perilla volatile oils tested contained 59.71 mg/mL perillaldehyde and 42.25 mg/mL perillene.Antibacterial test gainst displayed that E.coli，Staphylococcus aureus，Salmonella bacteria were significant inhibited，In particular，the inhibitory activity on Salmonella could achieve a similar effect to that of the control antibiotic，and a low concentration could achieve a good inhibitory effect.The research results showed that the two kinds of perilla volatile oil had good antibacterial effects and could be used as natural antibacterial agents.

Keywords：Perilla frutescens;volatile oil;antibacterial activity

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31860391）;省優(yōu)秀青年科技人才項目（黔科合平臺人才[2019]5656）;貴州省科研機構(gòu)創(chuàng)新能力建設(shè)專項資金項目（黔科合服企[2021]13）

紫蘇（Perilla frutescens），古名荏，又名引子、蘇子、白蘇、蘇麻、香蘇、蘇草及桂芢等，是唇形科紫蘇屬 1 年生草本植物。主要分布于中國的江蘇、湖北、廣東、廣西、河南、貴州、四川、韓國、日本等亞洲地區(qū)[1]。紫蘇是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，全株均可入藥[2]。其中，紫蘇葉具有解表散寒，宣肺化痰，行氣和中，主要用于感冒風(fēng)寒，咳嗽妊娠嘔吐，魚蟹中毒[3]。紫蘇葉香氣濃厚，源于其中豐富的揮發(fā)油類物質(zhì)。《中華人民共和國藥典》規(guī)定，紫蘇葉以揮發(fā)油不得少0.40%為主要特征成分[4]。紫蘇葉揮發(fā)油具有良好的抗氧化、防衰老、增強免疫力、抑菌抗炎及抑制腫瘤細(xì)胞增長的功效[5]，因此在食品、藥品、化妝品、香料等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。紫蘇葉揮發(fā)油成分主要為單萜類，倍半萜類，苯丙素類和呋喃酮類等物質(zhì)。根據(jù)不同的主要單萜物質(zhì)，可將紫蘇分為多種化學(xué)型，如以紫蘇醛（perillaldehyde）為主要成分的PA型，以紫蘇烯 （perillene）為主要成分的PL型等[6-7]。不同化學(xué)型主效成分含量不同，功能和應(yīng)用必然存在差異。近年來，由于良好的抑菌及抗氧化活性，紫蘇葉揮發(fā)油在日化用品及護膚品中應(yīng)用顯著增加[8]。有關(guān)紫蘇揮發(fā)油的研究已有不少報道，但對于不同化學(xué)型的紫蘇葉揮發(fā)油活性研究報道較少。因此，本研究以紫蘇中兩種主要的化學(xué)類型：紫蘇醛和紫蘇稀型揮發(fā)油，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等細(xì)菌的抑菌活性進(jìn)行考察，可為紫蘇揮發(fā)油的應(yīng)用開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫蘇醛型及紫蘇烯型紫蘇材料為課題組前期收集并鑒定的種質(zhì)資源。2018年種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗基地。4月中旬播種，5月中旬定植，種植密度為5500 株/667m2，正常水肥管理。花前期收獲紫蘇葉片，陰干干燥，用于揮發(fā)油提取。

試驗菌株大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella choleraesuis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為課題組保藏菌株。紫蘇醛、紫蘇烯標(biāo)準(zhǔn)品均購于武漢天植。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇揮發(fā)油的提取

采取水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油[9-11]，取干燥紫蘇葉粉碎，過65目篩。500 mL蒸餾水加入50 g紫蘇粉末，連接蒸餾裝置，蒸餾5 h，收集油相液體。收集液體加入 10 mL 的石油醚進(jìn)行萃取，去掉下層水相，連續(xù)萃取 2～3次，合并萃取液。在萃取液中加入適量的無水硫酸鈉去除掉殘留水份，4 ℃過夜，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 5 min 去掉石油醚，即得到供試所需紫蘇揮發(fā)油。

1.2.2 揮發(fā)油成分測定

取供試揮發(fā)油用甲醇稀釋1000倍，采用GC-MS檢測成分。氣相條件：RXT-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 μm×0.25 μm）;柱前壓為63.9 kPa;不分流;進(jìn)樣量為500 μL;進(jìn)樣口溫度為260 ℃;載氣為He;柱初溫為80 ℃，保留1 min，再經(jīng)過15 ℃/min的升溫速率，升至300 ℃，保留15 min。完成一個樣品檢測時間為31 min。MS條件：電離方式為EI，燈絲電流0.5 mA;電子能量70 eV;倍增器電壓0.86 kV;離子源230 ℃，溶劑延遲1 min;質(zhì)核比m/z：40～500。結(jié)果根據(jù)安捷倫定性軟件檢索NIST譜圖庫，結(jié)合人工化學(xué)結(jié)構(gòu)解析判定，鑒定成分種類。由峰面積歸一法計算揮發(fā)油各化學(xué)成分的相對百分含量。并根據(jù)紫蘇醛、紫蘇烯揮發(fā)油標(biāo)準(zhǔn)品比較，計算絕對百分含量。

1.2.3 菌株的活化及制備

用劃線法將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌接種于LB固體培養(yǎng)基中， 37 ℃培養(yǎng)24 h。分別取上述菌株的新鮮培養(yǎng)物，分別取不同的菌種置于LB液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)至OD值為0.6備用。

1.2.4 體外抑菌試驗

將定性濾紙用打孔機打成直徑為0.6 cm的圓形紙片[12]，高壓滅菌備用。紫蘇揮發(fā)油分別稀釋為60%，80%及100%的溶液備用。分別吸取0.1 mL培養(yǎng)菌液（OD=0.6）放入LB固體培養(yǎng)基中，均勻涂布，靜置5 min。將平板均分為6個區(qū)域[13]，分別取滅菌紙片放入不同濃度紫蘇揮發(fā)油溶液中浸潤，然后均勻間隔貼于培養(yǎng)基表面，輕壓使之接觸良好。以無菌水作陰性對照，以卡納霉素（1 g/L），頭孢霉素（5 g/L）作陽性對照。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察抑菌圈直徑大小，用直尺進(jìn)行測量并記錄結(jié)果，試驗設(shè)置3次重復(fù)，求其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇揮發(fā)油成分定性分析

采用水蒸氣蒸餾法提取紫蘇揮發(fā)油，獲得兩種類型揮發(fā)油采用GC-MS檢測成分。紫蘇醛、紫蘇烯揮發(fā)油總離子流圖見圖1。紫蘇醛型樣品揮發(fā)油檢測，其中含有紫蘇醛，石竹烯，等單萜類成分，其中紫蘇醛相對含量為71.98%，采用標(biāo)準(zhǔn)品定量分析，其絕對含量為59.71 mg/mL。紫蘇烯型樣品揮發(fā)油檢測，其中含有紫蘇烯，檸檬醛等單萜類成分，其中紫蘇烯相對含量為90.76%，采用標(biāo)準(zhǔn)品定量分析，絕對含量為42.25 mg/mL。

2.2 紫蘇醛揮發(fā)油抑菌活性分析

紫蘇醛型揮發(fā)油對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗可以看出，不同濃度的紫蘇醛型揮發(fā)油均對三類菌有顯著的抑制效果（圖2）。為探究不同濃度紫蘇醛揮發(fā)油對三類菌抑制作用是否存在顯著差異，試驗采用單因素方差法對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。運用 SPSS Statistics 25.0 對不同濃度紫蘇醛揮發(fā)油抑菌圈大小均值進(jìn)行單因素方差分析（表2），由表可知不同濃度紫蘇醛揮發(fā)油對大腸桿菌抑制作用之間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。60%濃度與100%濃度紫蘇醛揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑制作用相比存在顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012<0.05），且100%紫蘇醛揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑菌作用優(yōu)于60%紫蘇醛揮發(fā)油。60%濃度與80%、100%濃度紫蘇醛揮發(fā)油對沙門氏菌抑菌作用相比存在顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012<0.05、P=0.006<0.05），且100%紫蘇醛揮發(fā)油對沙門氏菌抑制作用優(yōu)于80%紫蘇醛揮發(fā)油。紫蘇醛型的紫蘇揮發(fā)油對沙門氏菌抑菌效果優(yōu)于陽性對照頭孢霉素及卡納霉素，對沙門氏菌抑菌效果非常好。2.3 紫蘇烯揮發(fā)油抑菌活性分析

紫蘇烯型紫蘇揮發(fā)油對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果可以看出，不同濃度的紫蘇烯型揮發(fā)油均對三類菌有一定的抑制效果（圖3）。為探究不同濃度紫蘇烯揮發(fā)油對三類菌抑制作用是否存在顯著差異，試驗采用單因素方差法對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。運用 SPSS Statistics 25.0 對不同濃度紫蘇烯揮發(fā)油抑菌圈大小均值進(jìn)行單因素方差分析（表3），由表可知60%濃度與100%濃度紫蘇烯揮發(fā)對大腸桿菌抑菌作用相比差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014<0.05），且100%紫蘇烯揮發(fā)對大腸桿菌抑菌作用優(yōu)于60%紫蘇烯揮發(fā)油。60%濃度與100%濃度紫蘇烯揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑菌作用相比存在顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.013<0.05），且100%? 注：不同濃度的紫蘇烯型揮發(fā)油對大腸桿菌（E.coil）的抑制效果（a.柱狀圖，b.抑菌平板照片）。不同濃度的紫蘇烯型揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑制效果（c.柱狀圖，d.抑菌平板照片）。不同濃度的紫蘇烯型揮發(fā)油對沙門氏菌的抑制效果（e.柱狀圖，f.抑菌平板照片）。

紫蘇醛揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于60%紫蘇醛揮發(fā)油。不同濃度紫蘇烯揮發(fā)油對沙門氏菌的抑菌作用之間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 紫蘇醛與紫蘇烯揮發(fā)油抑菌活性差異分析

為探究兩種化學(xué)型紫蘇揮發(fā)油對三類菌抑菌效果是否存在顯著差異，試驗采用獨立方差分析法對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。運用 SPSS Statistics 25.0對兩種紫蘇揮發(fā)油對三類菌抑菌圈大小均值進(jìn)行獨立樣本T檢驗（表4），由表可知兩種紫蘇揮發(fā)油對三類菌抑菌效果之間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 結(jié)論與討論

紫蘇原產(chǎn)于中國，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，在我國有著非常悠久的應(yīng)用歷史。我國也是世界上紫蘇栽培及出口量最大國家，目前20多個省均有紫蘇野生及栽培報道[14]。紫蘇葉揮發(fā)油可作為香料應(yīng)用于香水中，作為芳香藥物用于芳香療法中，作為調(diào)味劑和防腐劑加入食物中，作為保健品調(diào)理人體機能，作為抗衰老成分用于護膚品中，根據(jù)紫蘇葉揮發(fā)油的藥理活性可預(yù)測將來有望將其開發(fā)成潛在的新型消炎抗菌藥、抗腫瘤藥、抗抑郁藥及降壓藥等藥物用于減輕人類病痛，也可將其開發(fā)成天然的農(nóng)藥[15]。目前，紫蘇葉精油已廣泛用于保健品及化妝品行業(yè)，研究開發(fā)及經(jīng)濟價值已倍受國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。對紫蘇中揮發(fā)油類、 黃酮類、 酚酸類及萜類化合物的提取鑒定及其抗炎抑菌、 抗氧化、 抗腫瘤等生物學(xué)活性作用研究較多[16]，對于不同化學(xué)型紫蘇揮發(fā)油研究尚有不足，本文對于兩種不同化學(xué)型紫蘇揮發(fā)油紫蘇醛型與紫蘇烯型，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌活性進(jìn)行研究。

大腸桿菌為革蘭氏陰性短桿菌是人和動物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進(jìn)入腸道，與人終身相伴，在一定條件下可以引起人和多種動物發(fā)生胃腸道感染[17]。金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，為典型的革蘭氏陽性菌，可引起人和動物的感染，也是導(dǎo)致食物中毒比較常見的食源性細(xì)菌，可以引起人和動物多種感染，如人的一般皮膚感染、食物中毒到甚至危及生命的疾病[18]。沙門氏菌屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌，傳播范圍比較廣，一般寄生在人體和動物體內(nèi)，引致人畜發(fā)生傷寒、敗血癥、胃腸炎以及腹瀉等病癥[19]。這三種細(xì)菌均與人和動物的生活息息相關(guān)。研究結(jié)果表明：紫蘇醛型揮發(fā)油和紫蘇烯型揮發(fā)油對三類菌均良好的抑菌效果，其中紫蘇醛型揮發(fā)油濃度改變對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑制作用影響明顯，尤其是對沙門氏菌，60%濃度時與80%濃度時抑菌效果存在差異顯著，對大腸桿菌抑制作用影響不明顯。紫蘇烯揮發(fā)油濃度改變對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制作用影響明顯，均在濃度100%時抑菌效果較好，對沙門氏菌抑制作用影響不明顯，較小濃度紫蘇烯揮發(fā)油對沙門氏菌就能達(dá)到較好的抑制作用。通過對兩種紫蘇揮發(fā)油抑菌效果作比較，發(fā)現(xiàn)兩種紫蘇揮發(fā)油對三類菌的抑制作用沒有明顯差異，均具有良好的抑制作用，說明兩類紫蘇揮發(fā)油均可以作為天然的抑菌劑，用于日化產(chǎn)品的開發(fā)。目前已有報道，紫蘇葉揮發(fā)油具有良好的抗氧化、防衰老、增強免疫力、抑菌抗炎及抑制腫瘤細(xì)胞增長的功效[20]，可作為醫(yī)療工程、香料工程原料及工藝品進(jìn)行開發(fā)利用，在天然抑菌劑和日化用品及護膚用品的應(yīng)用前景也非常廣闊。本研究為紫蘇的后續(xù)開發(fā)利用提供理論支撐。

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通訊作者：沈奇（1983—），女，博士，研究員，主要從事藥用植物遺傳育種研究，E-mail： shenqi@gzucm.edu.cn.