慢性心力衰竭患者外周血miR-133a的表達水平及其臨床意義*

馬利輝，孫明霞，郭 娜

河北省邯鄲市中心醫(yī)院急診外一科，河北邯鄲 056009

慢性心力衰竭是多種心血管疾病發(fā)展的終末階段，病理生理特征為心臟舒縮功能減退、心排血量減少并出現(xiàn)乏力、呼吸困難、發(fā)紺等臨床表現(xiàn)，嚴重影響患者的日常生活，威脅患者生命安全，需要積極進行防治[1]。目前，關(guān)于心力衰竭的發(fā)病機制尚未有統(tǒng)一的結(jié)論，細胞凋亡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等均被證實與心力衰竭有關(guān)[2-4]。微小RNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子RNA，多種miRNA在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，參與多個生物學(xué)環(huán)節(jié)。在心肌梗死后心力衰竭大鼠模型中，心肌miR-133a的表達水平明顯降低且外源性補充miR-133a能夠改善心力衰竭、抑制心肌細胞凋亡[5]，提示miR-133a可能在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程中靶向抑制細胞凋亡，但心力衰竭患者外周血中miR-133a表達水平的變化及其對細胞凋亡的靶向調(diào)控作用的報道較少。為此，本研究以慢性心力衰竭患者為研究對象，分析了外周血miR-133a表達水平變化的臨床意義，并探討了miR-133a對凋亡分子的可能靶向作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年3月至2018年12月在本院診斷為慢性心力衰竭的患者54例為心力衰竭組，入組標準：(1)符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》中關(guān)于慢性心力衰竭的診斷標準[6]；(2)臨床資料完整；(3)均留取外周血及血清標本。排除標準：(1)美國紐約心臟病學(xué)會(NYHA)心功能分級Ⅰ級；(2)合并肥厚性心肌病、心肌梗死、心源性休克、心臟瓣膜病；(3)合并感染、惡性腫瘤、結(jié)締組織病；(4)合并肝、腎功能異常。另選取同期本院體檢健康者50例為對照組。所有入組對象均知情同意并經(jīng)本院倫理委員會批準。心力衰竭組中男29例，女25例；年齡49～68歲，平均(61.38±12.82)歲；平均體質(zhì)量指數(shù)(22.39±6.82)kg/m2；有吸煙史22例，有飲酒史28例，NYHA Ⅱ級18例，Ⅲ級24例，Ⅳ級12例。對照組中男26例，女24例；年齡43～66歲，平均(56.69±11.83)歲；平均體質(zhì)量指數(shù)(21.93±6.24)kg/m2；有吸煙史20例，有飲酒史25例。兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑 血液RNA提取試劑盒(型號DP419)、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(型號KR201)、miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(型號FP401)均購自北京天根公司；B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2，型號F3016)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax，型號F00152)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3，型號F10010)的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒均購自上海西唐公司；7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；680酶標儀購自美國Bio-Rad公司；IU22彩色多普勒超聲儀購自荷蘭飛利浦公司。

1.3方法

1.3.1外周血miR-133a表達水平的檢測 心力衰竭組入院后當天或次日，對照組體檢時抽取肘靜脈血3 mL，采用血液RNA提取試劑盒分離、提取靜脈血中的RNA，采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，采用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒對cDNA中的miR-133a和U6進行熒光定量PCR擴增反應(yīng)，miR-133a的上游引物序列為5′-ATC GAT CGA TGC TAG CTA T-3′，下游引物為試劑盒通用引物。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s 重復(fù)40個循環(huán)。反應(yīng)完成后在軟件中自動生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以U6為內(nèi)參、計算miR-133a的表達水平。

1.3.2血清凋亡分子的檢測 心力衰竭組入院后當天或次日，對照組體檢時抽取肘靜脈血3 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心20 min，分離上清液后采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3的水平，按照試劑盒的說明書進行操作。

1.3.3心力衰竭指標的檢測 采用彩色多普勒超聲診斷儀進行檢查，檢查由經(jīng)驗豐富的超聲科醫(yī)生操作，得到超聲心動圖后計算左室射血分數(shù)(LVEF)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)及左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)。另取血清標本，采用全自動生化分析儀檢測腦鈉肽(BNP)的水平。

2 結(jié) 果

2.1心力衰竭組與對照組外周血miR-133a及血清凋亡分子的比較 心力衰竭組外周血中miR-133a的表達水平及血清中Bcl-2的水平低于對照組，血清中Bax、Caspase-3的水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2心力衰竭組中不同NYHA分級患者外周血miR-133a及血清凋亡分子的比較 心力衰竭組中NYHA Ⅲ級及Ⅳ級患者外周血中miR-133a的表達水平及血清中Bcl-2的水平低于NYHA Ⅱ級患者，血清中Bax、Caspase-3的水平高于NYHA Ⅱ級患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且NYHA IV級患者外周血中miR-133a的表達水平及血清中Bcl-2的水平低于NYHA Ⅲ級患者，血清中Bax、Caspase-3的水平高于NYHA Ⅲ級患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3心力衰竭組與對照組心功能指標的比較 心力衰竭組LVEF低于對照組，LVEDD、LVESD及血清中BNP水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.4心力衰竭組患者miR-133a、凋亡分子與心功能指標的相關(guān)性 心力衰竭組患者miR-133a、Bcl-2水平與LVEF呈正相關(guān)，與LVEDD、LVESD及BNP呈負相關(guān)；心力衰竭組患者Bax、Caspase-3與LVEF呈負相關(guān)(P<0.05)，與LVEDD、LVESD及BNP水平呈正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

2.5心力衰竭組患者miR-133a與凋亡分子的相關(guān)性 心力衰竭組患者外周血miR-133a的表達水平與血清Bcl-2水平呈正相關(guān)(r=0.314，P<0.05)，與血清Bax、Caspase-3水平呈負相關(guān)(r=-0.291、-0.241，均P<0.05)。

表1 心力衰竭組與對照組外周血miR-133a及血清凋亡分子的比較

表2 心力衰竭組中不同NYHA分級患者外周血miR-133a及血清凋亡分子的比較

表3 心力衰竭組與對照組心功能指標的比較

表4 心力衰竭組患者miR-133a、凋亡分子與心功能指標的相關(guān)性

3 討 論

慢性心力衰竭的發(fā)病機制復(fù)雜且未完全闡明，與心力衰竭發(fā)病相關(guān)的因素包括細胞凋亡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、膠原增生、心肌重構(gòu)等[7-8]。近年來，miRNA在心血管系統(tǒng)中的調(diào)控作用受到了越來越多的關(guān)注，其中miR-133a是一種具有抗凋亡作用的miRNA。在心肌缺血再灌注、擴張型心肌病、糖尿病心肌病中，miR-133a表達水平的降低均被證實與疾病的加重、心功能的減退有關(guān)[9-11]。有研究表明，心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌miR-133a表達水平明顯降低、心肌細胞凋亡增加，而外源性補充miR-133a能夠抑制心肌細胞凋亡[5]，提示miR-133a可能參與心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展。為了驗證miR-133a在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究首先分析了心力衰竭患者外周血中miR-133a表達水平的變化，心力衰竭組患者外周血miR-133a的表達水平低于對照組，說明心力衰竭患者miR-133a表達水平降低，與心肌梗死后心力衰竭大鼠中miR-133a的水平變化趨勢一致，進而表明miR-133a表達水平的降低與心力衰竭的發(fā)生有關(guān)。

在心力衰竭的病情發(fā)展過程中，會逐步出現(xiàn)心肌收縮力不足、心臟射血量減少、心腔擴大及肺循環(huán)淤血等癥狀；心腔的擴大會牽拉心肌細胞并刺激BNP釋放增多。研究表明，心力衰竭患者的LVEF明顯降低，LVEDD、LVESD，以及BNP水平明顯升高且與心力衰竭的病情存在相關(guān)性[12-14]。本研究對慢性心力衰竭患者上述心功能指標的分析結(jié)果，與已有研究的報道一致，心力衰竭組患者的LVEF低于對照組，LVEDD、LVESD，以及BNP水平高于對照組。在此基礎(chǔ)上進一步分析miR-133a與心力衰竭病情的關(guān)系可知：心力衰竭患者的NYHA分級越高，miR-133a的表達水平越低，且miR-133a的表達水平與LVEF呈正相關(guān)，與LVEDD、LVESD及BNP呈負相關(guān)。說明miR-133a的水平降低與心力衰竭病情的加重有關(guān)，進而表明miR-133a表達水平的降低不僅與心力衰竭發(fā)生有關(guān)，還與心力衰竭病情的進展有關(guān)。

miRNA是一類非編碼小分子RNA，本身不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，其生物學(xué)作用的實現(xiàn)依賴于對下游多種靶基因表達的調(diào)控。在心肌梗死后心力衰竭大鼠模型中，miR-133a能夠靶向調(diào)控心肌細胞中線粒體凋亡基因Bax、Caspase-3的表達水平并抑制心肌細胞凋亡的發(fā)生[5]；另也有研究證實，上調(diào)miR-133a的表達水平能夠抑制離體培養(yǎng)的心肌細胞在缺血、缺氧條件下的凋亡[15]；在心肌成纖維細胞中，miR-133a能夠直接抑制Bcl-2的表達水平[16]。線粒體凋亡途徑受到Bcl-2和Bax的調(diào)控，前者能夠抑制凋亡，后者能夠促進凋亡，最終通過調(diào)控Caspase-3的表達和活化影響細胞凋亡[17-18]。心力衰竭患者在接受治療后，血清中促凋亡分子Bax、Caspase-3的水平明顯降低[19]。本研究對心力衰竭患者血清中凋亡分子的分析證實：心力衰竭組患者血清中Bcl-2的水平低于對照組，Bax、Caspase-3的水平高于對照組、且患者NYHA分級越高，Bcl-2的水平越低，Bax、Caspase-3的水平越高，說明線粒體凋亡途徑參與了心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展。進一步分析心力衰竭患者miR-133a與凋亡分子的相關(guān)性，結(jié)果表明miR-133a與Bcl-2呈正相關(guān)，與Bax、Caspase-3呈負相關(guān)。結(jié)合miR-133a在動物實驗及細胞中對凋亡的靶向抑制作用推測，心力衰竭發(fā)生過程中，miR-133a的表達水平降低可能使其靶向抑制細胞凋亡的作用減弱，繼而引起細胞凋亡過度激活并參與病情發(fā)展變化。

綜上所述，慢性心力衰竭患者外周血miR-133a表達水平降低，與NYHA分級、心功能變化有關(guān)，靶向凋亡分子可能是miR-133a發(fā)揮作用的途徑，miR-133a表達水平的監(jiān)測可作為評價心力衰竭病情的標志物，治療心力衰竭的靶點。在今后的研究中，還應(yīng)進一步收集心力衰竭早期的患者，以發(fā)現(xiàn)心力衰竭的預(yù)測因子及早期干預(yù)靶點。