河源市新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查及基因型分析*

劉運華，劉曉燕，張 旻，李登峰，曾慶林

廣東省河源市婦幼保健院醫學遺傳實驗室，廣東河源 517000

珠蛋白生成障礙性貧血是由一種或多種珠蛋白肽鏈合成受阻或抑制，導致血紅蛋白(Hb)組分異常，從而引起的溶血性貧血，是一種遺傳性溶血性疾病[1]。依肽鏈合成缺陷的差異，把珠蛋白生成障礙性貧血分為α、β、γ及δ 4種類型，α與β是主要的2種類型。不同國家發病率大約在1%～10%，在地中海地區的某些國家發病率高達10%[2]。我國長江以南大部分地區，尤其是廣東、廣西及海南地區是α-珠蛋白生成障礙性貧血的高發區[3]。依臨床癥狀的差異將α-珠蛋白生成障礙性貧血劃分為重、中、輕及靜止4種類型。中重度α-珠蛋白生成障礙性貧血嬰兒的出生給家庭和社會帶來了沉重的負擔。由于此類疾病無有效的治療方法，產前篩查與診斷是有效阻止此類重型疾病胎兒出生的有效手段[4]，故開展α-珠蛋白生成障礙性貧血普遍篩查對預防出生缺陷有較好的臨床價值。檢測新生兒期Hb Bart′s水平可作為α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查和臨床早期診斷的敏感指標[5-6]。2015年3月起，河源市新生兒疾病篩查中心開始篩查新生兒珠蛋白生成障礙性貧血。為分析河源市新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查結果與Hb Bart′s篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血的臨床價值，探索本地區新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血基因型分布特征，本研究對2015年3月至2019年10月的新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血的篩查結果與基因型分布特征進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 篩查標本為2015年3月至2019年10月來自河源市五縣二區的新生兒足跟血干血斑，共160 370例，其中男84 983例，女74 293例，性別未知1 094例。202例隨機對照標本為來自全市五縣二區的新生兒足跟血干血斑，新生兒中男119例，女83例；篩查與基因診斷均分兩批次與常規標本一起進行試驗。在知情同意條件下，嚴格遵循采血流程，于分娩后72～168 h采集新生兒足跟血3～4滴，將黃豆般大小的血滴在不接觸皮膚情況下慢慢滲過濾紙片；標本要求直徑≥8 mm，避免在紫外線或太陽照射的條件下晾干3～4 h后，密封保存于4 ℃冰箱。標本用快遞寄送至本中心，收到標本后5個工作日內采用全自動毛細管電泳儀進行篩查，及時召回初篩陽性個體檢測珠蛋白生成障礙性貧血基因。

1.2儀器與試劑 全自動毛細管電泳儀Capillarys2與進口配套Hb電泳試劑盒(含溶血素、沖洗液、緩沖液等)均購自法國Sebia公司；DNA自動提取儀Lab-Aid 824及配套試劑盒購自廈門致善公司；PCR擴增儀與電泳儀購自美國Bio-Rad公司；分子雜交儀ZWY-200D購自上海智城公司；珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷試劑盒與耗材購自深圳亞能公司。

1.3方法

1.3.1Hb電泳 每例標本打下1個直徑為3.5 mm干血斑放入樣品杯，用移液器加純凈水50 μL每杯，封好樣品杯并移進濕盒，于4 ℃冰箱浸泡2 h以上或過夜，充分洗脫干血斑中紅細胞，以待上機電泳。運用全自動毛細管電泳儀進行檢測，操作步驟如下：讀取樣品架條形碼、溶血素稀釋標本、清洗樣品針、清洗毛細管、標本注入毛細管、電泳、分析各Hb成分的濃度，含正常HbF、HbA和Hb變異體(S、C、E、D與Hb Bart′s)，HbA2帶和部分Hb Bart′s帶由人工判讀。

1.3.2基因檢測 及時召回篩查陽性新生兒(檢出Hb Bart′s帶)重新采血，檢測珠蛋白生成障礙性貧血基因；(--SEA、-α4.2、-α3.7)等缺失突變與αT(CS、QS、WS)3種點突變及17種β-珠蛋白生成障礙性貧血基因[CD41-42(-TTCT)、CD43(G>T)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、-29(A>G)、-28(A>G)、CD 71-72(+A)、CD17(A>T)、CD26(G>A)、-30(T>C)、-32(C>A)、CAP(-AAAC)、Int(T>G)、CD14-15(+G)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、IVS-Ⅰ-1(G>T)、IVS-Ⅰ-5(G>C)]，分別運用跨越斷裂點聚合酶鏈反應與反向斑點雜交法檢測。

1.3.3質量控制 室內質量控制：(1)Hb電泳，每批次試驗均有第三方質控物，與普通標本一樣的操作流程。(2)基因檢測，每批次試驗均進行空白對照、陰性對照、陽性對照(包括主要的缺失或突變類型)；Hb電泳與基因檢測的分析前、中、后均嚴格按照標準操作流程進行。室間質評：珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測參加廣東省臨床檢驗中心與國家臨床檢驗中心的室間質評，均滿分通過。

1.3.4結果判讀標準 α-珠蛋白生成障礙性貧血初篩陽性判讀標準：如果電泳結果讀到Hb Bart′s帶，就可判讀為α-珠蛋白生成障礙性貧血初篩陽性?；蛟\斷判讀標準：根據試劑廠家提供的判讀標準。

2 結 果

2.1篩查與基因檢測結果 篩查160 370例標本，檢出Hb Bart′s帶標本16 804例，篩查陽性率為10.48%。召回本院分娩的1 348例α-珠蛋白生成障礙性貧血初篩陽性新生兒，確診α-珠蛋白生成障礙性貧血患兒1 271例，診斷符合率為94.29%。共檢出基因型別27種，靜止型5種，標準型5種，中間型5種，α合并β-珠蛋白生成障礙性貧血12種。1 271例α-珠蛋白生成障礙性貧血新生兒中，靜止型占27.93%(355/1 271)，基因型以-α3.7/αα與-α4.2/αα為主；標準型占67.82%(862/1 271)，基因型以--SEA/αα為主；中間型占2.05%(26/1 271)，基因型以--SEA/-α3.7為主；α合并β珠蛋白生成障礙性貧血占2.20%(28/1 271)，基因型以(--SEA/αα)/(βCD41-42/βN)和(--SEA/αα)/(βIVS-Ⅱ-654/βN)為主。見表1。

2.2Hb Bart′s水平與臨床表型的關系 α-珠蛋白生成障礙性貧血靜止型355例，Hb Bart′s水平為0.34±0.11，標準型862例，Hb Bart′s水平為2.08±0.78，中間型26例，Hb Bart′s水平為10.60±3.37，Hb Bart′s水平隨臨床表型的加重而逐步增高，3種臨床表型Hb Bart′s水平比較，差異有統計學意義(F=2 145，P<0.05)。

表1 篩查與基因檢測結果

2.3202例新生兒足跟血四格表分析結果 隨機同時檢測202例標本的Hb Bart′s水平、3種缺失突變和3種非缺失突變的α-珠蛋白生成障礙性貧血基因。陽性符合率為91.89%，95%置信區間為78.70%～97.21%；陰性符合率為99.39%，95%置信區間為96.65%～99.89%；總符合率為98.02%，95%置信區間為95.02%～99.23%。另外，未檢出Hb Bart′s帶167例(確診2例-α3.7/αα、1例αWSα/αα珠蛋白生成障礙性貧血)。見表2。

表2 202例新生兒足跟血四格表分析結果(n)

3 討 論

缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血以--SEA/αα、-α4.2/αα和-α3.7/αα 3種基因型較為普遍。常見非缺失型突變α-珠蛋白生成障礙性貧血有HbCS、HbQS與HbWS，是發生在α2-珠蛋白基因或其調節序列上的點突變，影響mRNA的加工、翻譯及翻譯后肽鏈穩定性等過程[7-9]。珠蛋白生成障礙性貧血是目前世界上發病率最高的單基因遺傳病，據世界衛生組織統計，全世界約有18億人攜帶珠蛋白生成障礙性貧血基因，每年約有20萬以上各類重癥珠蛋白生成障礙性貧血新生兒出生[10]。

廣東省的珠蛋白生成障礙性貧血攜帶率僅次于廣西壯族自治區，主要類型是α-珠蛋白生成障礙性貧血、β-珠蛋白生成障礙性貧血[3]。因此，普遍開展人群α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查對廣東省出生缺陷防控項目有重大戰略意義。目前，能最終診斷α-珠蛋白生成障礙性貧血的試驗依據是分子水平的基因檢測，但其成本及技術要求相對較高，致使其不能成為α-珠蛋白生成障礙性貧血普遍篩查的常規方法。臨床上用于α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查的常規技術有血常規檢查聯合紅細胞脆性試驗、Hb電泳法、高效液相色譜法。因血常規檢查聯合紅細胞脆性試驗篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血有較高的漏檢率，所以不可單獨運用。同時，技術要求高、干擾因素較多及成本高的高效液相色譜法也不能開展普遍篩查。故當前國內運用于α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查最常見的方法是Hb電泳。Hb電泳主要有瓊脂糖Hb電泳和毛細管Hb電泳，因為毛細管Hb電泳方法更有優勢[5]，大部分新生兒篩查中心實驗室采用毛細管電泳技術篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血。

α-珠蛋白生成障礙性貧血的產生機制是α-珠蛋白基因缺失或點突變造成α-珠蛋白鏈合成減少，導致非α鏈相對過剩而形成四聚體；新生兒期γ鏈形成四聚體，Hb電泳結果即表現為Hb Bart′s帶[11]。在新生兒期，利用臍血Hb電泳、Bart′s定量測定技術篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血，其結果與基因檢測結果診斷符合率為91.8%；兒童及成人期，利用靜脈血Hb電泳、HbA2定量技術篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血，診斷符合率為75.1%[5]。目前，運用毛細管Hb電泳技術篩查新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血的報道中，大部分是采集臍血作為標本進行電泳。與臍血比較，新生兒出生后3～7 d采集足根血干血斑篩查α-珠蛋白生成障礙性貧血更有優勢，因為干血斑標本方便各合作單位的寄送，又可永久儲存，更有利于該技術的管理與全面推廣。

本研究中，篩查與基因診斷符合率為94.29%，稍高于葉立新等[5]、黃金芬等[10]、陳小蘭等[12]報道的診斷符合率，表明運用全自動毛細管電泳技術篩查新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血可滿足臨床需求。隨機同時檢測Hb Bart′s水平與珠蛋白生成障礙性貧血基因的202例的對照標本中，篩查與珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷符合率為91.89%，低于上述的94.29%，可能是隨機對照標本部分篩查陽性新生兒屬于稀有型珠蛋白生成障礙性貧血，不在所用試劑的檢測范圍內，也可能是Hb Bart′s水平與基因檢測符合率有差異的原因；也不排除操作誤差引起。未檢出Hb Bart′s帶的標本167例(確診2例-α3.7/αα、1例αWSα/αα珠蛋白生成障礙性貧血)，結果表明該技術無法檢出少部分靜止型α-珠蛋白生成障礙性貧血，與WU等[13]提出的Hb Bart′s帶不能作為新生兒-α3.7/αα型珠蛋白生成障礙性貧血的篩選方法觀點相符；但與ALAUDDIN等[14]報道的利用毛細管電泳系統分析Hb Bart′s方法可以篩選新生兒非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血稍有差異。

本研究提示，依據Hb Bart′s水平可初步判斷α-珠蛋白生成障礙性貧血分型，確診1 271例α-珠蛋白生成障礙性貧血中，有402例Hb Bart′s水平在0%～<1%，靜止型343例(85.32%)；844例Hb Bart′s水平在1%～<5%，標準型810例(95.97%)；25例Hb Bart′s水平>5%，中間型(HbH病)24例(96.00%)。因沒有篩查出重型α-珠蛋白生成障礙性貧血個體，無法討論重型α-珠蛋白生成障礙性貧血Hb Bart′s的水平。

本研究檢出的基因型別27種，排在前3名基因型依次是--SEA/αα、-α3.7/αα與-α4.2/αα，此基因分布特點與相關研究的地區報道的α-珠蛋白生成障礙性貧血主要基因型別是一致的[15-18]，與本地區作者胡莉莉等[19]、劉平等[20]報道的α-珠蛋白生成障礙性貧血主要基因型別相同。

綜上所述，運用干血斑毛細管電泳技術篩查新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血有較高的診斷符合率，可在早期發現α-珠蛋白生成障礙性貧血。本研究闡明了河源地區α-珠蛋白生成障礙性貧血基因分布特征，以此制訂珠蛋白生成障礙性貧血防控策略，做好相關遺傳咨詢與宣傳工作，可指導廣大適婚人群進行合理婚育，提高新生兒出生質量。