酶法檢測肌酐水平降低的秘密：羥苯磺酸鈣的干擾

陳克娜 綜述，諶海蘭 審校

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，重慶 400016

肌酐是一種相對分子質(zhì)量較低的含氮化合物，是肌肉組織中肌酸的代謝終產(chǎn)物，它主要從腎小球濾過，不被腎小管重吸收，可作為評估腎小球濾過率和腎功能的重要指標(biāo)[1-2]。目前，臨床應(yīng)用較多的檢測肌酐的方法是苦味酸法和酶法。現(xiàn)在實驗室應(yīng)用酶法檢測肌酐的有70.4%，苦味酸法檢測肌酐的有29.6%[3]。然而，臨床上常出現(xiàn)肌酐檢測結(jié)果和患者臨床表現(xiàn)不符的情況。這與實驗室所用方法，儀器的特異度和抗干擾能力不同有關(guān)，也與多種物質(zhì)的干擾有關(guān)，特別是藥物的干擾，且不同藥物的干擾方向不盡相同[4]。

羥苯磺酸鈣是一種血管保護(hù)劑。它通過降低毛細(xì)血管通透性、血液黏度和血小板高活性來改善異常的血液流變學(xué)和微循環(huán)，在治療糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、慢性靜脈功能不全和各種微血管病變中發(fā)揮著重要作用[5]。研究表明羥苯磺酸鈣對慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎損傷也有治療作用[6]。但是，這一臨床常用藥物會對酶法檢測肌酐產(chǎn)生負(fù)干擾[6]，其干擾產(chǎn)生機(jī)制尚不明確。探究其干擾機(jī)制、尋求消除或減輕干擾的方法是一線工作者的重任。

1 臨床常用的肌酐檢測方法

目前，應(yīng)用于臨床實驗室的肌酐檢測方法已達(dá)10余種。其中，同位素稀釋質(zhì)譜法是血清肌酐檢測的決定性方法[7]，同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是我國肌酐檢測的參考方法[8]。由于每種方法的抗干擾能力不同，又受到檢測成本和通量的限制，目前臨床應(yīng)用較多的是苦味酸法和酶法。部分肌酐檢測方法的比較見表1。

表1 不同肌酐檢測方法的比較

1.1堿性苦味酸法 堿性苦味酸法是最經(jīng)典的肌酐檢測化學(xué)方法。其原理是肌酐在堿性條件下與苦味酸反應(yīng)生成橘紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物，通過比色法在505～520 nm波長處檢測樣品肌酐水平[8]。這種方法最早為臨床所用，但其抗干擾能力差，易受到多種非特異性色原的干擾，如膽紅素、抗壞血酸、α-酮酸、丙酮、乙酰乙酸、葡萄糖、蛋白質(zhì)、胍、胍乙酸內(nèi)酰胺等。盡管實驗室對苦味酸法進(jìn)行了一些改進(jìn)，比如使用新鮮配制的試劑、給試劑倉加防護(hù)罩減少試劑與空氣接觸、按時定標(biāo)保證試劑有效性、采用時差法檢測肌酐、吸附法去除干擾物等，仍然不能完全解決非特異性色原干擾的問題。

1.2肌氨酸氧化酶法 肌氨酸氧化酶法是酶法中的一種。肌氨酸氧化酶法根據(jù)原理不同還包括肌酐酰胺水解酶法和亞胺水解酶法[3]。肌氨酸氧化酶法是國內(nèi)臨床實驗室使用最多的肌酐檢測方法[9]，其檢測原理是肌酐在肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶的作用下逐步水解得到H2O2，生成的H2O2通過偶聯(lián)終點比色法反應(yīng)生成有色物質(zhì)，檢測肌酐水平[10]。

酶法應(yīng)用時間較晚，優(yōu)勢顯著，但也受到部分干擾物的影響，例如：5-氟胞嘧啶、酚磺乙胺、多巴胺、多巴酚丁胺、硝基甲烷、抗壞血酸、羥苯磺酸鈣等。其中，多巴胺、多巴酚丁胺能可逆地黏附于留置導(dǎo)管，使靜脈穿刺和留置導(dǎo)管標(biāo)本的肌酐檢測結(jié)果差異較大；而腎上腺素和去甲腎上腺素則不會黏附于留置導(dǎo)管，兩種類型標(biāo)本檢測結(jié)果差異小于5%[11]。另外，免疫球蛋白M會對酶法檢測肌酐產(chǎn)生正干擾，這種干擾可以通過超濾法消除[12]。苦味酸法和酶法的幾種常見干擾物及其干擾方向見表2。

表2 幾種常見物質(zhì)對肌酐檢測的干擾

研究顯示苦味酸法和酶法兩者檢測結(jié)果有良好的相關(guān)性(r=0.998，P<0.001)，但通過回歸分析其斜率和截距發(fā)現(xiàn)兩者的檢測結(jié)果不能互換，且當(dāng)肌酐水平低于180 μmol/L時，與酶法比較，苦味酸法的最大正偏倚為14.1%[10]。在實際應(yīng)用方面，苦味酸法的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、平均回收率、抗干擾能力均比酶法低，并且由于線性范圍略小而無法準(zhǔn)確檢測高出一定水平范圍的肌酐[1]，因此，酶法被越來越多的臨床實驗室采用。

2 羥苯磺酸鈣對肌酐檢測的干擾

2.1羥苯磺酸鈣的藥代動力學(xué) 含有羥苯磺酸鈣的商品有多貝斯、昊暢、安多明、導(dǎo)升明等。羥苯磺酸鈣多為口服，用法一般為500 mg/次，2～3次/日。該藥主要以原形通過腎臟、腸道排泄，僅有10%以代謝產(chǎn)物排泄。口服給藥后24 h內(nèi)大約各有50%從尿液和糞便中排泄[18]。健康人群單次口服500 mg羥苯磺酸鈣后，3～6 h血藥水平可達(dá)峰值，其濃度約為8～15 μg/mL；靜脈給藥500 mg后，5 min血藥水平可達(dá)峰值，濃度為65 μg/mL[19]。羥苯磺酸鈣血漿半衰期在5 h左右[20]，在人體內(nèi)可達(dá)到的谷濃度和峰濃度范圍分別是2.66～8.33 μg/mL和12.83～23.15 μg/mL[21]。服用羥苯磺酸鈣后的穩(wěn)態(tài)濃度平均為6.64 μg/mL[6]，服用后血藥濃度半衰期為穩(wěn)態(tài)濃度的95%左右[9]。

2.2羥苯磺酸鈣的作用機(jī)制 已有研究證實羥苯磺酸鈣在治療糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變中的療效和安全性較好[22]。在ZHOU等[23]的研究中，羥苯磺酸鈣可降低糖尿病腎病患者的內(nèi)皮功能障礙標(biāo)志物水平，例如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、內(nèi)皮素-1，同時炎癥標(biāo)志物例如正五聚體蛋白3(PTX3)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、超敏C-反應(yīng)蛋白、細(xì)胞間黏附分子的水平也降低，但一氧化氮(NO)水平升高，且腎小球濾過率沒有變化。通過回歸分析發(fā)現(xiàn)PTX3、NO和糖化血紅蛋白是糖尿病腎病的影響因素。NJAU等[24]研究發(fā)現(xiàn)羥苯磺酸鈣可抑制VEGF165誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性、遷移、增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(VEGFR-2)的磷酸化，并且可抑制VEGFR-2介導(dǎo)的信號級聯(lián)活性。此外，在VEGF滿足生理水平以維持腎小球完整性的情況下，羥苯磺酸鈣可降低糖尿病小鼠腎臟的VEGF信號，改善糖尿病腎病和周圍神經(jīng)病變。上述研究結(jié)果提示羥苯磺酸鈣是VEGF的抑制劑，沒有完全阻斷VEGF的負(fù)面影響，可作為治療糖尿病腎病的有效藥物。在ZHANG等[25]的研究中，羥苯磺酸鈣通過降低患者纖溶酶原激活物抑制劑-1和纖維蛋白原的水平降低尿激酶和組織型纖溶酶原激活物的活性，從而激活纖溶酶原并減輕腎小球硬化的程度。

2.3羥苯磺酸鈣對肌酐檢測的負(fù)干擾 羥苯磺酸鈣應(yīng)用廣、市場價格低，是一種長效使用藥物，但體內(nèi)和體外研究均證實羥苯磺酸鈣會對酶法檢測肌酐產(chǎn)生負(fù)干擾，并且短期內(nèi)服用沒有明顯的腎臟保護(hù)作用，還會通過負(fù)干擾影響腎功能的正確評估[26]。

羥苯磺酸鈣對酶法的干擾程度與干擾物及肌酐基礎(chǔ)水平相關(guān)。當(dāng)外源添加的羥苯磺酸鈣濃度達(dá)到4 μg/mL時，與未添加羥苯磺酸鈣的肌酐檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[19]，當(dāng)外源添加的羥苯磺酸鈣水平達(dá)到8 μg/mL時，即可使8種酶法肌酐檢測系統(tǒng)的結(jié)果下降4.4%～36.3%[6]，且羥苯磺酸鈣水平越高，負(fù)干擾越嚴(yán)重。在GUO等[6]的研究中，低水平肌酐受羥苯磺酸鈣的干擾最大，其次是中水平、高水平。并且受試者口服500 mg羥苯磺酸鈣后的血藥水平與肌酐濃度曲線趨勢相反，但在此過程中胱抑素C水平?jīng)]有明顯變化，這暗示羥苯磺酸鈣與肌酐檢測結(jié)果呈負(fù)相關(guān)。羥苯磺酸鈣除了對肌酐檢測產(chǎn)生負(fù)干擾，也會對尿酸、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、糖化清蛋白等產(chǎn)生一定負(fù)干擾[27]，且對尿酸、三酰甘油的負(fù)干擾較為明顯[21]。

羥苯磺酸鈣引起的負(fù)干擾對腎功能不全患者可能會產(chǎn)生更嚴(yán)重的影響。對于腎功能不全患者，羥苯磺酸鈣對酶法檢測的負(fù)干擾導(dǎo)致結(jié)果假性降低，使患者誤認(rèn)為該藥物有明顯的改善腎功能的作用，可能出現(xiàn)錯誤的藥物減量或停藥。并且腎功能不全患者腎小球濾過率低，藥物容易堆積，干擾可能更嚴(yán)重。余久如等[28]的研究也證實了這一說法，特別是當(dāng)估算腎小球濾過率低于12 mL/(min·1.73 m2)時，穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣水平急劇升高。對于腎小球濾過率正常的患者，服藥24 h血藥水平均在6 μg/mL以上，所以無論何時采集血液標(biāo)本都極有可能對酶法檢測肌酐產(chǎn)生負(fù)干擾[9]。

慢性腎臟病(CKD)分期直接依賴于腎小球濾過率[29]，其結(jié)果的差異將影響腎小球濾過率在判斷和估計CKD進(jìn)展中的應(yīng)用[30]。宋亞男等[26]對服用羥苯磺酸鈣合并CKD的患者進(jìn)行了CKD分組研究，CKDⅠ～Ⅱ期患者的肌酐檢測及腎功能評估受到羥苯磺酸鈣的影響小，但CKDⅢ～Ⅴ期肌酐檢測及腎功能評估受到明顯的負(fù)性影響，尤其對CKDⅤ期的患者影響更為明顯。

2.4負(fù)干擾產(chǎn)生機(jī)制的假說 羥苯磺酸鈣對酶法檢測肌酐的負(fù)干擾早有報道[6]，但產(chǎn)生負(fù)干擾的機(jī)制尚不明確。有學(xué)者提出了以下3種假說[6]：(1)酶法檢測肌酐是基于肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶降解肌酐及其反應(yīng)產(chǎn)物，然后通過偶聯(lián)終點比色法反應(yīng)檢測肌氨酸氧化產(chǎn)生的H2O2，而羥苯磺酸鈣的基本結(jié)構(gòu)是對苯二酚環(huán)，它具有還原性，可能會消耗H2O2，從而產(chǎn)生負(fù)干擾。(2)羥苯磺酸鈣可能與偶聯(lián)終點比色法反應(yīng)中的其他成分發(fā)生反應(yīng)，從而減少生色基團(tuán)的形成，使檢測結(jié)果假性降低。(3)羥苯磺酸鈣可能會影響生色基團(tuán)的穩(wěn)定性。第1種假說是被較多學(xué)者認(rèn)可的假說，也是目前試劑廠商等解決干擾問題的出發(fā)點。明確羥苯磺酸鈣對肌酐檢測產(chǎn)生負(fù)干擾的確切機(jī)制將有利于選擇正確的檢測方法從而消除或減小誤差。

3 討 論

肌酐是評估腎小球濾過率和腎功能的重要指標(biāo)之一，最小化血清肌酐的總允許誤差水平是臨床醫(yī)生準(zhǔn)確診斷急性腎損傷等腎臟病變的必要條件[31]。鑒于肌酐檢測會受到多種物質(zhì)的干擾，建議醫(yī)師送檢血樣時說明患者所用藥物的名稱或囑患者停用一些對檢測有干擾的藥物(如羥苯磺酸鈣)一段時間后再檢測。且對于服用羥苯磺酸鈣的肌酐檢測結(jié)果在進(jìn)行臨床評價時加以高度警惕，結(jié)合患者臨床癥狀判斷。如果同期尿素、胱抑素C等檢測結(jié)果沒有明顯降低，可選用其他檢測原理的方法進(jìn)行復(fù)核，也可用酶法和干片法同時檢測肌酐，進(jìn)行結(jié)果比較。肌酐檢測標(biāo)本盡量避免使用留置導(dǎo)管血[17]，且不宜采用全血標(biāo)本及溶血標(biāo)本[1]，因為紅細(xì)胞中的假肌酐較多。對于腎功能不全患者，藥物蓄積引起的負(fù)干擾可能更嚴(yán)重，因此該類患者的肌酐檢測結(jié)果和藥物減量應(yīng)引起臨床足夠的重視[9]。

對于肌酐的檢測有多種方法，檢測原理、試劑盒、檢測系統(tǒng)的差異對肌酐檢測結(jié)果的影響不容忽視，例如目前臨床應(yīng)用較多的酶法與堿性苦味酸法之間存在系統(tǒng)誤差，因此各臨床實驗室要對所用方法進(jìn)行系統(tǒng)評價，以明確其性能特點及檢測局限性[15]。在抗干擾方面，不管是采用酶法還是苦味酸法，干擾物對不同檢測系統(tǒng)的干擾程度和方向都可能存在差異，但總體而言干擾物對苦味酸法產(chǎn)生干擾的概率高于酶法[14]。并且在酶法基礎(chǔ)上建立的參考方法可以有效完成血清肌酐的檢測，此方法與袁鵬飛等[32]驗證檢測的結(jié)果一致，有利于為血清肌酐常規(guī)檢測系統(tǒng)的方法或物質(zhì)溯源提供有效途徑，因此酶法代替苦味酸法檢測肌酐的優(yōu)勢顯而易見。