白內障患者NOS、DPP及TFAR19蛋白的表達及臨床意義

張紅振 王二麗 朱樂如

白內障為世界致盲疾病之首，隨著我國人口老齡化加劇，白內障患病率逐年升高。如何防治白內障，保護白內障按患者視力成為眼科醫生研究的熱點。既往研究表明，自由基氧化損傷會加重晶狀體氧化損傷程度，但其對白內障患者影響的相關研究結果尚未完善［1-2］。二肽基肽酶（DIPEPTIDYL peptidase，DPP）在細胞死亡及蛋白降解中發揮重要作用，有學者研究指出先天性白內障大鼠晶狀體中DPP 的表達會明顯高于正常對照組大鼠，且晶狀體渾濁程度更高［3］。凋亡相關蛋白19（apoptosis-associated protein19，TFAR19）已被較多學者證實與細胞凋亡關系密切，但其與白內障發病機制之間的關系鮮有報道［4-5］。本研究將深入探討白內障患者外周血中NOS、DPP 及TFAR19蛋白的表達情況及臨床意義，為臨床診治白內障提供理論依據。現研究報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月至2018年5月本院收治的64例白內障患者的臨床資料進行整理、分析。納入標準：①均為初次確診為白內障的患者，年齡在52～78 歲之間；②納入研究之前未進行白內障摘除術或其他藥物治療；③均在入院后行白內障囊外摘切除術。排除標準：①合并青光眼、高度近視、眼外傷等其他眼部疾病者；②代謝性白內障、過熟期白內障患者；③糖尿病病程長達5年的患者；④精神障礙無法配合治療者。

根據納入排除標準，本研究最終納入符合標準的64 例白內患者設為觀察組。其中男38 例，女26 例；平均年齡（60.41±2.58）歲；皮質性白內障26例，核性白內障20 例，后囊下性白內障18 例，健康組中男34 例，女30 例，平均年齡（60.21±2.47）歲。另選上述患者除去病變部位外的正常組織為對照組。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患者知情并簽署同意書。

1.2 方法

兩組均于入院或次日清晨空腹抽取靜脈血4 mL，4℃保存，自然凝固后以3 000 r/min 離心10 min，分離血清標本，-20℃冰箱保存備用。以酶聯免疫吸附法檢測血清中NOS 水平。試劑盒由上海江萊食物科技有限公司提供，檢測儀器為美國產的ELX808 酶標儀。

以免疫組化化學SP 染色測定DPP、TFAR19蛋白水平，兔抗人多克隆抗體DPP 及TFAR19 由美國Beckman Coulter 公司提供。將摘除眼球后極部鞏膜組織常規石蠟切片，梯度水化，抑制內源性過氧化物酶修復，4℃室溫孵育過夜，PBS 洗滌，滴加辣根過氧化物酶標記物，PBS 洗滌，DAB 顯色，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察DPP、TFAR19。

1.3 判斷標準

DPP 及TFAR19 蛋白陽性判斷標準［6］：腫瘤細胞胞質或細胞核中出現棕黃色或棕褐色顆粒。陽性細胞占比：0 分（無陽性，無色）；小于30.00%（1分，淡黃色）；大于等于30.00%（2 分，棕黃色），3 分（棕褐色）。陽性細胞所占百分比小于26%為1 分，陽性細胞所占百分比26%～50%為2 分，陽性細胞所占百分比51%～75%為3 分，陽性細胞壁大于75%為4 分；根據兩者相乘結果進行評判：小于3分（-）、3 分（+）、4 分（++）、5 分（+++）。陽性率=陽性例數/總例數×100%。

1.4 觀察指標

①對比觀察組與對照組血清NOS 水平及DPP、TFAR19 蛋白表達情況，并分析白內障組NOS、DPP、TFAR19 的表達與患者臨床特征之間的關系。②觀察患者術后視力恢復情況，以術后3 個月視力結果為標準，依據視功能問卷（visual function，VF）［7］評估患者術后視力恢復情況。該問卷包括主觀視覺、周邊視野、視覺適應、立體視覺4 個指征，依據患者主觀感覺從無困難到嚴重困難分為4級，得分1～4 分，總分0～100 分。視力正常或接近正常：VF 評分大于等于60 分；視力損傷：VF 評分在60 分以下。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；影響患者視力預后的相關因素采用非條件單因素和多因素Logistic回歸分析；以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NOS、DPP及TFAR19在兩組中的表達情況比較

觀察組NOS 水平、DPP 及TFAR19 陽性表達率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 NOS、DPP 及TFAR19 在兩組中的表達情況［（n）%，（±s）］Table 1 Comparison the expressions of NOS，DPP and TFAR19 in the two groups［（n）%，（±s）］

表1 NOS、DPP 及TFAR19 在兩組中的表達情況［（n）%，（±s）］Table 1 Comparison the expressions of NOS，DPP and TFAR19 in the two groups［（n）%，（±s）］

組別觀察組對照組t/χ2值P 值n 64 64 NOS（ng/mL）1.58±0.30 1.23±0.22 7.526 0.001 DPP陽性46（71.88）14（21.87）32.125 0.001陰性18（28.12）50（78.13）TFAR19陽性40（62.50）18（28.12）15.259 0.001陰性24（37.50）46（71.88）

圖1 免疫組化染色圖（SP，×500）Figure 1 Immunohistochemical staining（SP，×500）

2.2 NOS、DPP 及TFAR19 表達與白內障患者臨床特征的相關性

NOS、DPP 及TFAR19 的表達與白內障患者年齡呈顯著正相關（P＜0.05），與患者性別、不同類型、合并糖尿病、合并高血壓之間無顯著相關性（P＞0.05）。見表2。

2.3 影響白內障患者術后矯正視力預后的單因素分析

通過分析影響白內障患者術后矯正視力預后的單因素，發現：性別、不同類型、合并高血壓為非影響白內障患者術后視力預后的單因素（P＞0.05）；年齡、合并糖尿病、NOS、DPP、TFAR19為影響患者術后矯正視力預后的單因素（P＜0.05）。見表3。

表2 NOS、DPP 及TFAR19 表達與白內障患者臨床特征的相關性Table 2 Correlation between expression of NOS，DPP and TFAR19 and clinical features of cataract patients

表3 影響白內障患者術后矯正視力預后的單因素分析Table 3 univariate analysis on the prognosis of postoperative corrected visual acuity in cataract patients

2.4 影響白內障患者術后視力預后的多因素分析

選取有條件的單因素經非條件多因素Logistic回歸模型進一步分析，得出：年齡（≧65 歲）、NOS表達（高水平）、DPP 表達（陽性）、TFAR19 表達（陽性）影響白內障患者術后視力預后的獨立危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響白內障患者術后視力預后的多因素分析Table 4 multivariate analysis of visual acuity prognosis in cataract patients

3 討論

白內障為老化、遺傳、環境等因素引起的晶狀體代謝紊亂，晶狀體蛋白變形而變渾濁，嚴重影響患者的視力，該病的發生及發展的確切機制至今尚未明確。相關研究結果表明，白內障的發生與晶狀體氧化損傷之間聯系密切，其中以自由基對晶狀體的損傷最為嚴重［8］。但由于直接檢測患者機體內的自由基較為困難，NOS 為促進自由基合成的限速酶，臨床多采用檢測NOS 來間接反映自由基含量［9］。本研究采用酶聯免疫吸附法測定血清中NOS，并使用免疫組化化學染色的方法檢測DPP、TFAR19，分析其與患者臨床特征及術后視力預后之間的關系。

有學者研究報道NOS 在眼部脈絡膜、睫狀體、視網膜等各個組織均有表達，但正常生理情況下呈低表達狀態［10］。本研究結果顯示，觀察組NOS水平高于對照組，DPP 及TFAR19 陽性表達率明顯高于對照組，這一研究結果與既往文獻報道結果相似［11］。既往文獻報道，白內障患者晶狀體中的NOS 表達會高于無眼部疾病者［12］。NOS 參與正常生理狀態下自由基的合成，在機體處于病理狀態時，可受內毒素、白細胞介素-1 等介質刺激，產生大量一氧化氮合酶，生成過量的自由基并發揮細胞毒效應［13］。本研究結果進一步證實，白內障患者NOS 的過度表達與白內障病變相關。DPP 是定位于囊泡系統的細胞內溶酶體蛋白酶，早期有學者報道，從豬、大鼠等動物的晶狀體中檢測出DPP［14］。Herman 等［15］指出，DPP 存在于嚙齒動物的晶狀體中。XU 等［16］采用免疫組化染色法，檢測到DPP 存在有睫狀體無色素上皮細胞、晶狀體上皮細胞、晶狀體纖維層等結構中，由此推測DPP 的表達與白內障的發生有關。TFAR19 是最早由北京大學發現的一種與細胞凋亡關系密切的蛋白質，存在于人體50 多種組織，是參與細胞凋亡和抑制細胞生長過程的重要蛋白質。

本研究通過分析NOS、DPP、TFAR19 與患者臨床特征的關系，發現年齡與白內障患者上述指標的表達有顯著相關性。考慮為年紀越大的患者機體老化程度加速及局部營養障礙嚴重，會加大白內障的發生幾率，從而刺激NOS、DPP、TFAR19表達。但由于本研究已排除合并糖尿病病程長達五年的患者，因此在本研究中合并糖尿病僅為影響白內障患者手術矯正視力預后的單因素而非獨立危險因素，代謝性疾病對白內障患者術后視力預后的影響還有待進一步深入研究。

綜上所述，NOS、DPP、TFAR19 在白內障患者中呈高表達，NOS、DPP、TFAR19 表達與患者年齡有密切聯系，上述指標表達過高會影響患者手術矯正視力預后。但由于本研究納入樣本量較少，且未進行其前瞻性研究，實驗結果難免存在偏倚，相關指標的表達與白內障發生、進展及預后的關系尚需進一步研究。