拉曼光譜技術與神經退行性疾病研究進展

周珂軒 梁昊岳 孔曉冬

1天津醫科大學總醫院保健醫療部（老年醫學科），天津市老年病學研究所（天津 300052）；2中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所），實驗血液學國家重點實驗室，國家血液系統疾病臨床醫學研究中心（天津 300020）

神經退行性疾病是老年人認知功能障礙的常見病因，最常見的神經退行性疾病包括阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）、帕金森病（Parkinson′s disease，PD）、多系統硬化（multiple Sclerosis，MS）、亨廷頓舞蹈病（Huntington′s disease，HD）和肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等。上述疾病都有不同的流行病學、臨床癥狀、實驗室和神經影像特征、神經病理學和治療方法，其臨床表現多種多樣，主要表現為進行性認知功能障礙［1-2］。近年來，盡管神經退行性疾病的診斷方式日益增多，但隨著拉曼光譜技術的發展及其在多個領域中的廣泛應用，其在神經醫學診斷中的價值也日益提高［3］。

1 神經退行性疾病診斷現狀

神經退行性疾病發病的分子機制還未完全明了，是導致老年人群疾病和殘疾的主要原因，造成重大的社會經濟負擔［4］。神經退行性疾病的特征是與疾病相關的靶神經元的物理衰退，并最終失去周圍的非特異性神經細胞支持［5］。目前臨床診斷方式多樣，常用的手段如顱腦MRI、CT、PETCT、病理診斷、腦脊液生物標記物技術等，以上檢查手段或操作復雜，或費用昂貴，對神經退行性疾病診斷敏感度和特異度不高，診斷效果并不理想，亟待發現一種簡便快捷的診療手段［6］。

2 拉曼光譜技術

拉曼光譜技術（Raman spectroscopy，RS）即拉曼散射產生的光譜，是1928 年由印度物理學家拉曼發現的［7］。即一定頻率的光照射到物質上發生彈性散射和非彈性散射，彈性散射的散射光是與激發光波長相同的成分，非彈性散射的散射光有比激發光波長長的和短的成分，統稱為拉曼效應。由于拉曼譜線的數目、位移的大小、譜線的長度直接與試樣分子振動或轉動能級有關，因此，這項技術可探測與樣品中化學鍵相關的分子振動或旋轉，以獲得關于分子結構、組成和分子間相互作用的信息［8］。作為一種研究分析結構的工具，拉曼光譜從物質分子非彈性散射產生的分子振動光譜識別和區分不同的化學結構及官能團，具有快速、非破壞性及微量精細分辨能力、標本無需處理、不用試劑和高度自動化、相對低的成本提供實時分子信息和高分辨率成像等優點，在醫學領域發展迅速，如癌癥的早期診斷及結石病、白內障、動脈硬化等疾病的診斷研究，已獲得很多突破性進展［9-10］。拉曼光譜技術只需簡單的試樣準備，可在近乎生理條件下保留醫學試樣，并可用于活體試樣，能為醫療過程中實時診斷提供可能性，這是其他技術所不具備的。現已發展表面增強拉曼光譜技術（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）、尖端增強拉曼光譜技術（tip enhanced Raman spectroscopy，TERS）、傅里葉變換拉曼光譜技術（fourier transform Raman spectroscopy，FT-Raman）、共振拉曼散射（resonance Raman scattering，RRS）、相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-stokes Raman scattering，CARS）等，廣泛用于生命科學研究［11-12］。

3 拉曼光譜技術在神經退行性疾病中的作用

拉曼光譜技術可以提供快速、無標記、實時的信息，這對于研究神經環境是至關重要的［10］。研究表明，傅里葉變換紅外光譜可對各種樣品類型進行極快速、高通量和非破壞性的分析，它能夠以最少的樣品制備同時分析碳水化合物、氨基酸、脂肪酸、脂質、蛋白質、核酸和多糖，因此被認為是一種有價值的代謝指紋分析工具，目前是診斷癡呆的一種有用且準確的方法［13］。研究發現，利用尖端增強拉曼光譜技術作為納米尺度上具有空間分辨率的表面敏感工具，可以檢測由相同多肽序列和不同毒性水平形成的兩個樣品中單個蛋白質低聚物的空間結構和表面特征［14］。已有研究表明，淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）與Aβ42或Aβ40 與Aβ42 的比值可能是AD 有研究前景的生物標志物，表面增強拉曼散射技術利用膠體合成銀納米探針，可高靈敏性、選擇性和多重檢測血液中的Aβ40 和Aβ42，并且不受水分干擾、非光漂白的特點使其成為檢測各種神經退行性疾病生物標志物的重要研究工具［15］。

與既往神經退行性疾病診斷方法相比，拉曼光譜技術具有獨特的優勢。這些優勢主要在于拉曼光譜可以提供特定和敏感的生物標志物指紋，無需貴重基材或抗體標記、非侵入性、并且幾乎不需要樣品制備，有可能在便攜式、低成本的平臺上進行快速、多路分析。同時，在不損害標本的情況下，可以確定正常和疾病組織的特征，了解神經退行性疾病發生和發展的潛在機制，并進行治療效果觀察。基于這些優勢，拉曼光譜與多變量分析等方法相結合，可以很好地進行細胞或分子水平的檢測，為低成本快速鑒別神經退行性疾病提供了新的方法和思路。

但是，這項技術同樣也存在一些不足，由于拉曼光譜技術目前還在不斷完善，其信噪比相對較低、光譜解釋復雜、信息化程度不高，缺少大規模實驗數據統計分析和信息化程度高、操作方便的軟件作為支撐，同時，較長的采集時間以及從患者樣本到光譜采集的低效工作流程等，給臨床工作帶來一定的挑戰，使該項技術尚未作為常規臨床技術引入［16-17］。

3.1 拉曼光譜技術與ADAD 是一個日益嚴重的全球健康問題，對個人和社會都有巨大的影響，目前全世界有4 400 萬人患有癡呆癥。AD 的主要病理特征是淀粉樣斑塊Aβ 和神經原纖維纏結，并且可有神經元變性，突觸和神經元丟失。其最常見的臨床表現是潛伏的、進行性的認知功能障礙及近期記憶力喪失。疾病后期，可能會出現行為改變、行動能力受損、幻覺和癲癇［18］。早期識別和診斷AD顯得尤為重要。MICHAEL 等［19］利用高光譜拉曼顯微鏡對4 名捐贈者（包括3 名AD 和1 名健康志愿者）的額葉皮質組織和海馬組織切片進行分析。在樣本中含有Aβ 斑塊的區域發現蛋白質含量、β-折疊含量和自體熒光明顯較高，這表明該技術可以用來識別AD 患者腦組織中斑塊的位置。PALOMBO 等［20］使用拉曼顯微鏡對患有AD 的小鼠大腦中含有Aβ 斑塊組織的化學圖譜進行了繪制，發現這些斑塊的核心富含蛋白質，包裹著一層脂質環。脂質環被認為是由這些區域中大量的星形膠質細胞造成的，這可能表明神經炎斑塊和慢性神經炎之間的聯系。LOPES 等［13］用傅里葉變換紅外光譜研究AD 患者單核白細胞的酰胺I 帶平均光譜的結果表明，對照組和中度AD患者組在1 640 cm-1～1 625 cm-1范圍內存在差異，此區域是檢測Aβ 的峰位范圍。在此光譜范圍內，1 631 cm-1和1 638 cm-1處波峰明顯增強，并分別與Aβ 折疊結構和β-折疊蛋白有關。另外，1 683 cm-1處的增強峰也與β-折疊有關，所有這些差異在AD 中都很明顯，并與氧化應激相關。另一項研究也提示，富含Aβ40 和Aβ42 的蛋白質或多肽區域導致1 672 cm-1處波峰增強，而1 658 cm-1處波峰減弱被認為與α-螺旋結構有關。

3.2 拉曼光譜技術與帕金森病帕金森病是全世界第二大常見的神經退行性疾病［21］，其主要臨床特征為運動癥狀，如震顫、僵硬、運動遲緩、步態和平衡障礙以及非運動癥狀，包括認知下降、行為、感覺、睡眠和自主神經問題［22］。帕金森病的病理特征是大腦基底節，特別是黑質的細胞死亡，以及α-突觸核蛋白（α-Synuclein，α-SYN）在許多剩余神經元中的積聚。多巴胺能黑質紋狀體神經元與路易小體的變性被認為是帕金森病運動障礙的主要神經病理相關因素［21-23］。錯誤折疊的α-SYN 堆積成病理性聚集體被認為在帕金森病的發病機制中起著中心作用，可引起細胞毒性，并導致細胞死亡，α-SYN 還促進線粒體功能障礙，干擾內質網和高爾基體功能，擾亂細胞器軸突運輸［22］。成像生物標記物正越來越多地應用于帕金森病的診斷，為臨床觀察提供支持，包括分子成像、經顱超聲、磁共振成像和光學相干斷層掃描［24］。近年來，細胞外囊泡（extracellular Vesicles，EVS）被認為是α-SYN 在全身轉移的載體和關鍵角色，參與錯誤折疊的α-SYN 的傳播，從而參與疾病的傳播。EVS 可能是α-SYN 聚集的加速器，作為多種PD 相關分子的載體，被認為是PD 的新生物標志物，但在臨床環境中對其檢測和表征存在一定的技術局限性。GUALERZI 等［23］應用拉曼光譜技術用于細胞外囊泡的分析，作為帕金森病的診斷和預測工具。帕金森病患者和健康人的血清中提純EVS 后，對EVS 進行拉曼光譜分析，證明該方法在區分帕金森病患者和對照組方面具有一定的準確性，還證明了拉曼數據與帕金森病臨床評分之間的相關性。循環中EVS 的拉曼光譜可以作為帕金森病患者分層、評估康復和藥物治療效果的可靠、自動化和靈敏的方法。在帕金森病研究領域，拉曼光譜被用于研究單體和聚集的α-SYN 的結構特征和變化。此外，拉曼光譜技術還被用于分析帕金森病患者的血液，檢測患者血漿的光譜指紋與健康對照組的不同，還可以提供對樣品的整體生化特征的洞察力，在EVS 光譜中可以清楚地檢測到與核酸、蛋白質和脂質相關的峰。帕金森患者出現的視覺障礙是其發病的重要原因，研究發現，拉曼光譜可以區分正常和病變視網膜，也可以檢測與帕金森病相關的視網膜病變的分子變化，α-SYN 的累積可能導致神經炎癥、代謝失調和感光細胞死亡。MAMMADOVA 等［25］證明了使用拉曼光譜來識別表達人A53T 基因α-SYN 突變的轉基因小鼠模型TgM83 視網膜組織中疾病特異性分子特征的方法。結果表明，拉曼光譜可能成為有帕金森視網膜病變患者安全、有效的早期診斷途徑。

3.3 拉曼光譜技術與脫髓鞘疾病IMITOLA 等［26］描述了一種新的成像策略，將視頻率反射和熒光共聚焦成像與相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）顯微鏡相結合，應用于慢性實驗性自身免疫性腦脊髓炎（chronic experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）動物的活體組織，觀察到EAE 動物胼胝體和脊髓局部有嚴重的脂質信號丟失，提示脫髓鞘，軸突反射信號丟失。還觀察到出生后第7 天小鼠的小腦皮質下白斑（無髓鞘）和7 周齡小鼠（正常有髓）小腦的拉曼光譜信號，發現在發育的髓鞘形成過程中光譜信號增加。觀察結果表明，CARS 和反射成像相結合可以顯示正常成人和發育中的中樞神經系統的有髓軸突和無髓軸突。FU 等［27］利用CARS 顯微鏡和共聚焦拉曼顯微光譜相結合的方法記錄了不同階段復發性實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型的髓鞘的拉曼光譜，用CARS 成像定位了空白對照組白質中的正常髓鞘、脫髓鞘病變中的髓鞘碎片和緩解期再生的髓鞘。并且發現CARS 圖像能夠量化不同疾病階段的髓鞘厚度，并確定髓鞘厚度與軸突直徑的比率。CARS 顯微鏡可以有效地測定脫髓鞘疾病中脫髓鞘和再髓鞘形成的情況及髓鞘修復治療的結果。

多系統硬化是中樞神經系統的一種慢性炎癥性退行性疾病，以脫髓鞘和軸突變性為特征，然其病因尚不清楚，其癥狀、病程和轉歸各不相同。多發性硬化癥通常影響20～40 歲的患者，是美國和歐洲年輕人殘疾的主要原因［28-29］。多發性硬化患者與普通人群相比，其死亡率更高，預期壽命更短，在患有精神疾病、心腦血管疾病、糖尿病或癌癥等并存疾病的患者中更為明顯。成像技術的進步和診斷標準的不斷改進使MS 早期診斷成為可能［30］。BERGHOLT 等［28］開發了一種新的共注冊拉曼光譜和解吸電噴霧電離質譜（desorption electrospray ionization mass spectrometry，DESI-MS）結合免疫熒光成像的相關異譜脂質體（heterospectral lipidomic，HSL）方法用于動物模型和多發性硬化癥患者尸檢腦組織髓鞘的分類和分子表征，并首次用于直接觀察新形成的髓鞘與正常髓鞘組織成分的不同。結果表明，拉曼光譜不僅可以區分正常的、脫髓鞘的和有髓鞘的區域，還可以識別對照組織和重新髓鞘組織之間的脂質成分存在差異。在多系統硬化患者中，灰質和視網膜遭受慢性彌漫性炎癥過程，損害視網膜神經元。將拉曼光譜應用于多系統硬化損傷的視網膜各層，可以揭示多系統硬化所發生的分子變化，更好地探索多系統硬化的發病機制。MARRO 等［31］利用器官型視網膜培養物的拉曼光譜作為分子成像工具來研究視網膜疾病，監測了視神經炎小鼠整個炎癥反應過程中視網膜的生化成分，包括脂氧合酶、iNOS、TNF-α、細胞色素C、苯丙氨酸、NADH/NAD+和磷脂酰膽堿。此外，這些分子的含量反映了與視網膜炎癥相關的組織損傷。結果表明，視網膜的拉曼光譜結合偏最小二乘分析和多變量曲線分辨率分析可作為檢測、研究和監測視網膜和腦部疾病的一種有用的分子成像技術。

神經系統脫髓鞘疾病分型、分期復雜，起病更為隱匿，多為散發病例，發病率不高，病情進展快，病死率較高，起病方式及臨床表現多種多樣。疾病早期往往不被患者重視，癥狀出現前即可有相應的病理生理改變，難以進行早期診斷及鑒別診斷，必要時需取死亡患者腦組織標本進行病理分析確診，標本獲取困難，且不符合人類倫理要求。而動物模型相對容易建立，操作簡單、可控性強。綜上所述，目前拉曼光譜技術在神經系統脫髓鞘疾病中的研究還處于動物實驗階段，早期發現人類血清或腦脊液中特異性生物標志物對神經系統脫髓鞘疾病顯得尤為重要。

3.4 拉曼光譜技術與其他神經退行性疾病亨廷頓病是由亨廷頓蛋白基因（Huntingtin gene，HTT）第一外顯子中顯性遺傳的CAG 重復擴增引起的常染色體顯性遺傳性神經退行性疾病，以漸進性不自主舞蹈性運動、行為和精神障礙以及癡呆為特征［32］。早期檢測和識別HD 發病的生物標志物對疾病的治療和預后至關重要。HUEFNER 等［33］首次使用SERS 發現在雌性R6/2 小鼠（一種HD 轉基因小鼠模型）的皮質勻漿和血清樣本中有突變的亨廷頓聚集體累積并具有特定的光譜特征，發現HD小鼠與對照組相比在400 cm-1～1 200 cm-1光譜范圍內有明顯差異，并且證明在HD 患者中通過SERS 獲得其光譜生物標志物的可行性，提出這種方法可能在HD 的早期診斷和治療中發揮重要作用。

ALS 是一種成人起病的慢性、致命性神經退行性疾病，以大腦和脊髓運動神經元變性為特征，可導致進行性肌肉癱瘓，最終死于呼吸衰竭［34］。ZHANG 等［35］使用SERS 發現ALS 患者和健康對照組血漿樣本在722 cm-1和739 cm-1處存在顯著光譜學差異，ALS 患者在722 cm-1處腺嘌呤和輔酶A 強度明顯高于對照組，在739 cm-1處胸腺嘧啶和尿嘧啶也顯示出較高的信號，提示ALS 患者血漿中存在較高水平的DNA 或RNA 堿基。ALS 以胞漿內有毒蛋白聚集為顯著特征，氨基酸代謝異常可能與ALS 的發生發展有關。SERS 光譜也可以檢測到ALS 患者血漿中的幾種特征性氨基酸，包括精氨酸（493 cm-1）、酪氨酸（635 cm-1、1 618 cm-1）、色氨酸（760 cm-1、1 198 cm-1和1 618 cm-1）、L-絲氨酸（808 cm-1）和苯丙氨酸（1 001 cm-1和1 198 cm-1）等。以上研究表明，ALS 患者中葡萄糖、氨基酸及核苷酸等生物分子代謝異常有可能成為其潛在的生物標志物。

4 結論與展望

拉曼光譜技術是疾病診療中的一股新生力量，雖存在著一些不足，如光譜數據信號的有效處理、統一金屬粒子制備對表面增強拉曼光譜檢測的可重復性等。但是它與其他技術整合可能更具有發展潛能，為神經退行性疾病的診斷和治療開辟了新的領域［36］。在今后的臨床工作中可將拉曼光譜技術特定峰位與患者血清學生化指標相結合，例如，血清膽固醇、低密度脂蛋白、尿酸和腺苷脫氨酶等。深入探索拉曼光譜技術在神經退行性疾病研究中的應用，不僅有助于神經系統疾病的診斷，也可為預測疾病的預后提供方法學指導，具有廣闊的臨床應用前景。