丹參多酚酸鹽對過氧化氫誘導的血管內皮細胞損傷的影響及其機制

王海云，王俏，王代明，朱健，朱虹

(1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院急診科,上海 200011;2.上海市公惠醫院內科;3.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院·臨床醫學院)

急性肺損傷(ALI)是由肺內外各種因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫。肺損傷的典型臨床表現為進行性呼吸困難和頑固性低氧血癥。近年來研究表明，氧化應激是導致ALI的重要發病機制[1]。氧化應激是指體內氧化、抗氧化系統失衡所引起的異常改變，組織器官的氧化應激損傷是大多數疾病的病理生理基礎。氧化應激可產生大量的自由基，這些自由基如果不能及時的清除，將對機體產生損傷。其中，活性氧(ROS)對生物膜脂質過氧化損傷最為廣泛[2]。傳統活血化瘀中藥丹參臨床上常用于治療冠心病、心絞痛等疾病[3]。丹參多酚酸是中藥丹參的主要活性成分之一，丹參多酚酸鹽能保護心血管系統，具有擴張血管等作用[4-5]。本研究擬觀察丹參多酚酸鹽對過氧化氫(H2O2)誘導的血管內皮細胞氧化應激損傷的影響及對炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的調節，探討丹參多酚酸鹽保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自Gibco公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；CCK8試劑盒購自美國Selleck公司；Trizol試劑購于Invitrogen公司；PrimeScript RT Reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自Takara公司。丹參多酚酸鹽購自上海綠谷制藥有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養 人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)完全溶解復蘇后將其配制成細胞懸液，RPMI 1640 完全培養基在37 ℃的5%二氧化碳培養箱中恒溫培養24 h，更換培養液，在細胞呈單層貼壁生長后延長至每2至3天換液，多次換液培養至細胞生長融合達90%。

1.3 細胞傳代 取出HUVEC細胞，PBS洗盡殘留培養基，加入0.25%胰酶，用含10%胎牛血清的RPMI 1640終止消化。無菌吸管輕輕吹打，制成細胞懸液，加入適當的培養基，平均分在不同的培養皿中。

1.4 實驗分組 將貼壁的HUVEC細胞分成3組，對照組，H2O2組(H2O2200 μmol/L處理)和丹參多酚酸鹽組(丹參多酚酸鹽100 mg/L +H2O2200 μmol/L處理)。

1.5 CCK8法檢測細胞增殖 按104/孔的密度將細胞種于96孔板中，體積為100 μL，24 h細胞貼壁后，細胞分成3組，處理不同的時間后分別加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃避光孵育30 min，檢測450 nm吸光度，與對照孔比較計算細胞存活率。每日在相同時間點檢測，共檢測7 d。

1.6 紫外分光光度法測定HUVEC細胞MDA含量和SOD活性水平 三組HUVEC細胞分別處理72 h后，用PBS輕輕清洗細胞2次，加入細胞裂解液并刮取細胞，于4 ℃用1.2×104r/min離心10 min后取上清，BCA法測定蛋白含量。分別利用MDA及SOD比色法試劑盒檢測HUVEC細胞蛋白上清液中的MDA含量及SOD的活性。

1.7 qRT-PCR檢測HUVEC細胞IL-6、IL-1β、TNF-α及Nrf2的表達 根據NCBI上公布的各基因序列分別設計qRT-PCR用引物：IL-6 F/R:5′-CTTCTCCACAAGCGCCTTCG-3′，5′-TTCTCAGGGCTGAGATGCCG-3′；IL-1βF/R:5′-GGCCCTAAACAGATGAAGTGC-3′，5′-CCAGCATCTTCCTCAGCTTG-3′；TNFαF/R:5′-CCCAGGGACCTCTCTCTAATCA-3′，5′-AGCTGCCCCTCAGCTTGAG-3′；Nrf2 F/R:5′-TGCCAACTACTCCCAGGTTG-3′，5′-AGACTGGGCTCTCGATGTGA-3′；GAPDH F/R：5′-GTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；并由上海生物工程有限公司代為合成。三組HUVEC細胞分別處理72 h后，Trizol法提取細胞中的總RNA。根據Takara逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應生成cDNA，步驟按照試劑盒的說明進行。各基因對應上下游引物各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌雙蒸水8 μL。PCR反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，35個循環；65 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，選取GAPDH為內參基因。采用2-△△CT表示各基因的相對表達量。

2 結果

2.1 丹參多酚酸鹽對H2O2誘導的HUVEC細胞增殖的影響 CCK8實驗的結果表明，從第2天開始(F=19.199，P<0.01)至第7天(F=143.709，P<0.01)三組比較，差異有統計學意義。兩兩比較，從第2天開始至第7天，H2O2(200 μmol/L)能顯著抑制HUVEC的增殖，差異有統計學意義(P<0.01);應用丹參多酚酸鹽(100 mg/L)處理后，能顯著逆轉H2O2誘導的HUVEC細胞生長增殖抑制,提高細胞存活率(P<0.05)。見圖1。

注： H2O2為過氧化氫，HUVEC為人臍靜脈內皮細胞，下圖和表同；與對照組比較，aP<0.01；與H2O2組比較，bP<0.05

2.2 丹參多酚酸鹽對H2O2誘導的HUVEC細胞MDA含量和SOD活性水平的影響 分別處理72 h后，三組細胞之間的MDA(F=149.913,P<0.01)和SOD(F=123.760,P<0.01)的含量水平差異有統計學意義。H2O2組與對照組比較，H2O2(200 μmol/L)能誘導HUVEC細胞MDA含量顯著增加(t=14.501,P<0.01)，降低 SOD的活性水平(t=15.931,P<0.01)。丹參多酚酸鹽組與H2O2組比較，應用丹參多酚酸鹽(100 mg/L)能明顯降低HUVEC細胞的MDA水平(t=14.794,P<0.01)，提高SOD水平(t=11.819，P<0.01)。說明應用丹參多酚酸鹽(100 mg/L)處理后能顯著降低H2O2誘導的HUVEC細胞MDA含量的增加，并能提高細胞SOD的活性水平。見表1。

表1 丹參多酚酸鹽對H2O2誘導HUVEC細胞MDA 和SOD的影響

2.3 丹參多酚酸鹽對H2O2誘導的HUVEC細胞IL-6、IL-1β和TNF-α表達的影響 HUVEC細胞分別處理72 h后，三組細胞內IL-6(F=111.167，P<0.01)、IL-1β(F=278.121，P<0.01)和TNF-α(F=80.618，P<0.01) 的表達差異有統計學意義。分組比較發現，與對照組相比，H2O2(200 μmol/L)能顯著誘導HUVEC細胞IL-6(t=16.819，P<0.01)、IL-1β(t=26.181，P<0.01)和TNF-α(t=9.987，P<0.01)的表達增加；與H2O2組相比，應用丹參多酚酸鹽(100 mg/L)處理后能顯著降低H2O2誘導的HUVEC細胞IL-6(t=4.248，P<0.01)、IL-1β(t=14.864，P<0.01)和TNF-α(t=7.822，P<0.01)的表達增加。見圖2。

2.4 丹參多酚酸鹽對H2O2誘導的HUVEC細胞Nrf2表達的影響 三組HUVEC細胞分別處理72 h后，細胞內Nrf2的表達差異有統計學意義(F=16 858.879，P<0.01)。分組比較發現，與對照組相比，H2O2組細胞Nrf2表達的增加 (t=36.941，P<0.05)；與H2O2組相比，丹參多酚酸鹽組顯著提高了HUVEC細胞Nrf2的表達，差異有統計學意義(t=167.473，P<0.01)。見圖3。

注：IL-6為白細胞介素-6，IL-1β為白細胞介素-1β，TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與對照組比較，aP<0.01；與H2O2組比較，bP<0.01

注：Nrf2為核因子E2相關因子；與對照組比較，aP<0.05；與H2O2組比較，bP<0.01

3 討論

MDA是生物體內膜脂質過氧化的主要產物之一,具有細胞毒性，MDA含量增多可加劇膜的損傷。通過SOD和MDA含量可反映細胞氧化應激受損的程度[6]。本研究發現，用H2O2處理HUVEC細胞后能明顯增加細胞MDA表達的增加，并顯著降低細胞SOD的活性水平，說明H2O2可誘導HUVEC細胞的氧化應激損傷。應用丹參多酚酸鹽處理后能顯著降低細胞MDA含量，并能顯著增加細胞SOD的水平，說明丹參多酚酸鹽能有效抑制H2O2誘導的氧化應激損傷，保護血管內皮細胞。同時發現，應用丹參多酚酸鹽處理后能顯著逆轉H2O2誘導的HUVEC細胞的生長增殖抑制,提高細胞的存活率。有臨床研究表明丹參多酚酸鹽能降低冠心病患者MDA水平，增加SOD水平，有利于改善冠心病患者的氧化應激狀態[7]，表明丹參多酚酸鹽具有抗氧化應激的作用，能保護血管內皮細胞免受氧化應激的損傷。

氧化應激不僅損傷血管內皮細胞，而且還能增加炎性細胞因子的產生。本研究發現，H2O2處理HUVEC細胞發生氧化應激后，能使細胞內炎性細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達顯著增加。有研究表明，這些炎癥相關的介質可導致患者小氣道損傷與肺泡組織的破壞，從而逐漸出現呼吸功能障礙[8]。在應用丹參多酚酸鹽處理后，能顯著降低HUVEC細胞中這些炎性因子的表達，說明丹參多酚酸鹽可以抑制H2O2誘導的血管內皮細胞炎癥介質的過量表達和釋放，從而減輕炎性反應保護肺損傷。石清等[9]報道，丹參多酚酸鹽聯合氯吡格雷改善急性冠脈綜合征患者心功能和內皮功能，降低炎性因子。穆德廣等[10]利用急性肺損傷兔模型也證實，丹參多酚酸鹽能降低TNF-α、IL-1的水平。這些結果表明丹參多酚酸鹽能抑制炎性因子的表達和釋放，減輕炎癥級聯反應。

Nrf2信號通路是調控氧化應激的主要信號通路[11]。激活的Nrf2進入細胞核與特異的DNA序列結合，持續激活SOD等酶的表達，抑制血管內皮細胞活性氧的過量產生，發揮抗氧化應激的保護作用[12]。本研究顯示H2O2能誘導HUVEC細胞氧化應激的過程中Nrf2的表達增加，應用丹參多酚酸鹽后能顯著提高Nrf2的表達，說明丹參多酚酸鹽能通過增加Nrf2的表達發揮抗氧化應激的作用，保護血管內皮細胞。

綜上所述，H2O2能誘導HUVEC細胞發生氧化應激損傷及增加炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的產生，丹參多酚酸鹽能對H2O2誘導的HUVEC細胞的氧化應激損傷及炎性因子的過度表達發揮抑制作用，其機制可能與丹參多酚酸鹽能誘導HUVEC細胞上調Nrf2的表達有關。