七氟醚麻醉對腦缺血再灌注損傷大鼠學習記憶能力的影響

苗亞飛 楊木強 司馬靚杰 閆俊強

河南科技大學第一附屬醫院，河南 洛陽 471003

缺血性腦卒中是指由于腦的供血動脈(頸動脈和椎動脈)狹窄或閉塞、腦供血不足導致腦組織壞死的總稱。目前臨床上對于缺血性腦卒中的治療主要集中于溶解栓子，恢復正常血運，但血流再通時往往會造成腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)[1]，從而帶來嚴重的后遺癥，因此減輕再灌注損傷是治療缺血性腦卒中的重點。海馬組織對缺血后再灌注較為敏感，海馬損傷后往往會伴隨學習和記憶能力等認知功能的損害，影響患者的生活質量。CIRI的發病機制目前尚不明確，研究顯示炎癥反應是CIRI的主要原因之一[2-3]。S100β是細胞內鈣結合蛋白家族S100蛋白的成員之一，在中樞神經系統中表達豐富，研究表明組織細胞受損后S100β蛋白大量釋放，觸發炎癥反應，促進應激相關酶的釋放，從而導致細胞功能發生障礙，在神經細胞受損及炎癥反應加重中發揮作用[4]。顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是由Grn基因編碼的一種分泌性糖蛋白，具有促進細胞增殖、營養、抗炎等多種生理功能[5]，PGRN在神經炎性反應調節中發揮重要作用，研究表明炎性刺激會導致星形膠質細胞內PGRN表達升高[6]；此外，PGRN參與多種神經退行性疾病生理過程，并影響病后的認知功能與學習記憶能力[7-8]。七氟醚是臨床上常見的一種吸入性麻醉劑，研究表明七氟醚能夠在缺血性腦損傷過程中發揮腦保護作用[9]，因此，探究CIRI后大鼠學習記憶能力改變，以及S100β和PGRN的表達改變，可能為降低再灌注損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1．1藥品試劑與儀器七氟醚購于北京邁瑞達科技公司，Anti-S100 beta抗體購于英國Abcam公司，Anti-Progranulin/PGRN抗體購于英國R&D公司，HRP-山羊抗兔Ig G購于武漢Abbkin公司，蛋白提取試劑盒、蛋白含量檢測試劑盒及凝膠配制試劑盒均購于江蘇凱基生物公司，普通抗體稀釋液購于北京博奧森。

全自動冷凍研磨機購自上海凈信公司，便攜垂直電泳儀購自美國Bio-Rad公司，多功能成像儀購自美國通用電氣，多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher公司，純水制造機購自成都超純科技公司，全自動制冰機購自英國Grant公司，R500通用型小動物麻醉機購于深圳瑞沃德生命科技有限公司。

1．2實驗動物與分組取30只雄性SD大鼠，體質量(200±50)g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證編號：SCXK(京)2006-0009。將30只雄性SD大鼠隨機分為假手術組(Sham)、腦缺血再灌注組(CIRI)以及七氟醚后處理組(SEVO)，每組10只。

1．3模型建立采用改良Longa法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型[10-11]，CIRI組及SEVO組大鼠使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸旁行正中切口，玻璃分針分離頸部動脈，尋找到頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，使用動脈夾夾閉頸內動脈，在頸外動脈上做一切口，插入線栓，緩慢沿頸內動脈走向推進至稍有阻力為止，表明線栓已到達大腦前動脈端，可阻斷大腦中動脈血流。2 h后拔出線栓，再灌注24 h。Sham組僅做頸旁切開，不做線栓插入處理。

1．4七氟醚后處理將SEVO組大鼠置于麻醉臺，使用瑞沃德小動物麻醉機面罩吸入七氟醚及氧氣混合氣體，七氟醚體積分數3%，氧流量為1 L/min，持續吸入30 min。Sham組及CIRI組大鼠單純吸入氧氣30 min，氧流量保持一致。麻醉結束后將大鼠置于加熱墊上至自然蘇醒。

1．5神經功能缺損評分模型建立大鼠蘇醒后，各組隨機選取6只大鼠，使用改良大鼠神經功能缺損評分量表(mNSS)進行神經功能評分[12]，評分結果越高表明神經功能缺損越嚴重。

1．6TTC染色TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色用于檢測大鼠腦梗死情況。隨機選取各組大鼠4只，麻醉后斷頭取腦，腦組織置于冰上，使用大鼠腦模具沿視交叉處進行切片，片厚2 mm，連續切片5片，而后將腦片浸于1% TTC染色液中，37 ℃溫箱中浸染20 min，10%福爾馬林固定后，各組選取特征性腦片進行拍照分析。使用Image J軟件統計各組大鼠腦梗死體積百分比。

1．7Morris水迷宮測試Morris水迷宮測試由定位航行試驗與空間探索試驗兩個部分組成。在訓練開始的前 1 d，將各組大鼠在未放置逃生平臺的情況下自由游泳60 s。根據訓練效果剔出懶惰或過度活躍的大鼠。

1．7．1 定位航行試驗：為期6 d，前5 d為訓練，第6天測試。水下平臺始終固定于同一位置，每天大鼠從迷宮四個象限中部背朝箱壁釋入水中。若大鼠在60 s內爬上平臺，其找到平臺所需時間即為逃逸潛伏時間，若無法到達，將大鼠引導至水下平臺上停留15 s，逃逸潛伏時間記錄為60 s。

1．7．2 空間探索試驗：定位航行試驗結束后，于第7天撤除水下平臺，將大鼠離水下平臺所在位置最遠的象限釋放入水，記錄大鼠在60 s內穿過平臺所在位置的次數。

1．8檢測海馬組織S100β和PGRN蛋白表達水平采用Western bolt技術檢測各組大鼠海馬組織中S100β和PGRN蛋白表達水平。各組6只大鼠神經功能缺損評分結束后，麻醉斷頭取腦，腦組織置于冰上使用玻璃分針快速剝離海馬組織，投入液氮速凍。配制全蛋白提取液：1 mL冷蛋白裂解液中加入10 μL 100 mmol/L的PMSF、10 μL磷酸酶抑制劑以及1 μL蛋白酶抑制劑混勻，每100 mg組織加入1.5 mL提取液，置于全自動冷凍研磨機中研磨30 s，取出置于4 ℃離心機12 000 r/min離心10 min，吸取上清轉入新EP管中，BCA法測定蛋白濃度。配置10%聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣30 μg，80 V恒壓30 min，后轉為120 V恒壓電泳，電泳結束后用濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗大鼠S100β單克隆抗體(1∶2 000)、兔抗大鼠PGRN多克隆抗體(1∶200)和兔抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，滴加ECL發光液顯影成像，測量每張膜的灰度值。

2 結果

2．1mNSS評分與Sham組比較，CIRI組及SEVO組mNSS評分均明顯增高(P<0.001)，SEVO組mNSS評分相對于CIRI組明顯下降(P<0.001)。見圖1。

2．2TTC染色及腦梗死體積百分比CIRI組及SEVO組大鼠梗死體積百分比均明顯高于Sham組(P<0.001)，與CIRI組相比，SEVO組大鼠梗死體積百分比明顯降低(P<0.001)。見圖2。

2．3Morris水迷宮結果1～5 d的訓練結果表明，隨著訓練時間的延長，SEVO組大鼠逃逸潛伏期相對于CIRIC組有所縮短。定位巡航試驗中，與Sham組相比，CIRI組大鼠逃逸潛伏期顯著延長(P<0.01)；與CIRI組相比，SEVO組大鼠的逃逸潛伏期明顯減短(P<0.05)。空間探索試驗中，與Sham組相比，CIRI組大鼠穿越平臺次數減少，差異有統計學意義(P<0.01)，SEVO組大鼠穿越平臺次數則相對于CIRI組有所增加(P<0.05)。見圖3。

2．4Westernblot結果與Sham組相比，CIRI組大鼠海馬S100β表達明顯增加(P<0.01)，SEVO組亦有所增加(P<0.05)，而相對于CIRI組，SEVO組表達則明顯降低(P<0.05)。與Sham組相比，PGRN表達量在CIRI組大鼠海馬中顯著增加(P<0.001)，在SEVO組中也顯著增加(P<0.01)，與CIRI組比較，SEVO組表達明顯降低(P<0.01)。見圖4。

圖1 各組大鼠改良神經功能缺損評分比較，****P<0.001 Figure 1 Score results of modified nerve defects in rats in each group．****P<0.001

3 討論

腦缺血再灌注損傷是各種缺血性腦血管疾病治療再通后的常見現象，具體機制尚不明確。目前研究表明CIRI的發生可能與自由基的產生、血腦屏障損傷、氧化應激、炎癥及細胞凋亡等有關[13]。再灌注發生后損傷部位被大量的中性粒細胞浸潤，致TNF-α、IL-6 和IL-1β等炎性細胞因子大量釋放，產生一系列的級聯反應，同時大量產生的活性氧自由基與大腦脂質反應產生大量MDA等脂質過氧化物，同時降低超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px等抗氧化酶的活性，從而導致組織氧化與抗氧化系統之間的動態平衡被打破，最終導致腦細胞損傷壞死[14-15]。本研究發現腦缺血再灌注損傷后的大鼠與假手術組相比，神經缺損評分及腦梗死體積百分比均顯著升高，同時水迷宮試驗表明CIRI組大鼠學習記憶能力與Sham組相比明顯下降，表明再灌注損傷可導致大鼠神經功能明顯受損，且與學習記憶相關的海馬區損傷較為明顯。

注：****P<0.001圖2 各組大鼠TTC染色及梗死體積百分比 A：Sham組大鼠腦片TTC染色；B：CIRI組腦片TTC染色；C：SEVO組腦片TTC染色；D：梗死體積百分比統計Figure 2 TTC staining and percentage of infarct volume of rats in each group.A：TTC staining of rat brain slices in Sham group；B：TTC staining of rat brain slices in CIRI group；C：TTC staining of rat brain slices in SEVO group；D：statistical result of infarct volume percentage

注：*P<0.05，**P<0.01圖3 Morris水迷宮檢測大鼠的學習和記憶能力 A：每組大鼠5 d訓練的逃避潛伏期；B：定位巡航試驗結果；C：空間探索試驗結果Figure 3 The Morris water maze measures the learning and memory abilities of rats．A：the escape latency of 5d training for each group of rats；B：experimental results of positioning cruise；C：experimental results of space exploration

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖4 Western-blot技術檢測S100β及PGRN在各組大鼠海馬中的表達 A：Western blot條帶；B：各組S100β相對表達量；C：各組PGRN相對表達量Figure 4 Western-blot technique was used to detect the expression of S100β and PGRN in the hippocampus of various groups of rats．A：Western blot strip；B：The relative expression level of S100β in each group；C：The relative expression level of PGRN in each group

七氟醚(sevoflurane，SEVO)是一種新型吸入性麻醉劑，具有誘導快、蘇醒快、易于控制、呼吸道刺激小、有一定的肌肉松弛等優點，目前在臨床麻醉中應用廣泛[16-17]。相關研究表明七氟醚在腦、腎、心肌及肺等臟器發生缺血再灌注損傷時均發揮保護作用[18-21]。本研究表明給予七氟醚吸入后處理的CIRI大鼠水迷宮逃逸潛伏期明顯縮短，說明七氟醚處理后大鼠的學習能力得到改善，去掉水下平臺后SEVO組大鼠在60 s穿越水下平臺的次數也顯著增加，表明七氟醚后處理大鼠的記憶能力也有所恢復。此外，神經缺損評分結果顯示SEVO組大鼠評分相對于CIRI組大鼠明顯下降，表明大鼠的神經損傷得到改善，同時TTC染色結果也表明七氟醚后處理的大鼠梗死體積百分比明顯降低，腦缺血情況得到改善。

S100β蛋白在CNS主要由星型膠質細胞產生，在少突膠質細胞、神經祖細胞以及外周組織的脂肪細胞、黑色素細胞、皮膚及軟骨細胞中亦有少量分泌[22-28]。在生理濃度下S100β可能通過與轉錄因子產生相互作用而維持正常細胞周期，增強鈣通道數量刺激神經生長，刺激星形膠質細胞增殖，促進神經細胞損傷修復。而過量分泌時S100β蛋白會導致細胞功能障礙，在神經細胞變性、炎癥反應惡化及神經退行性改變等過程中發揮作用[22-24]。本研究顯示，與Sham組相比，CIRI組大鼠S100β表達水平顯著增高，七氟醚處理后表達水平則明顯降低，表明七氟醚可能通過降低S100β表達水平而發揮神經保護作用。

作為一種神經營養劑，PGRN參與調節大鼠的運動和皮質神經元的生長和細胞凋亡過程[25，29-32]。研究表明PGRN參與缺血缺氧性腦損傷等急性腦損傷過程，使用體外培養的細胞建立氧糖剝奪模型會引起C6細胞系PGRN蛋白表達升高[33-38]。PGRN可能通過抑制炎性反應、減輕血腦屏障的破壞和促進神經保護作用[39-40]。此外，PGRN可通過降低VEGF表達，抑制缺血導致的血管通透性增加，從而發揮神經保護作用[26-30，41-43]。本研究顯示，與Sham組比較，CIRI組大鼠PGRN表達水平開始上升，表明機體內的PGRN開始修復受損的神經細胞，七氟醚后處理的大鼠海馬PGRN表達進一步升高，同時學習記憶能力得到改善，腦梗死體積縮小，表明七氟醚可能通過調高PGRN的表達參與腦缺血再灌注損傷后損傷神經的修復過程。

本實驗通過七氟醚后處理缺血再灌注損傷模型大鼠，表明七氟醚后處理大鼠學習記憶能力得到改善，腦梗死體積有所減小，七氟醚可能通過降低S100β及調高PGRN的水平發揮神經保護作用，本研究為治療缺血再灌注損傷提供新的思路。