GNβ3 C825T和NET T182基因多態性與兒童注意缺陷多動障礙相關性研究

梅 萍 張秋瑩

學齡期(6～12歲)兒童處在身心發展的重要階段，是心理以及行為發育趨于成熟的關鍵時期。注意缺陷多動障礙(Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD)是一種多見于學齡期兒童的精神障礙，該類型的兒童與其同齡正常兒童相比活動過度、注意力不集中，且常伴有學習成績低下和沖動等行為[1]。目前ADHD的病因及發病機制尚不十分明確。文獻報道稱[2]兒童行為問題會受到遺傳和環境因素共同影響，尤其是注意力分散、沖動等行為問題的發生可能更多地會受到遺傳因素的影響。隨著分子生物學的飛速發展，有關兒童行為問題候選基因的研究開始受到重視。研究發現[3]，G蛋白β3亞單位(G protein beta3 subunit，GNβ3) C825T基因與信號轉導的增強和離子轉運的活性相關，且介導的多個門控通道在精神障礙的發生中發揮重要作用，進一步研究發現[4]其通過調控G蛋白與重要的中樞性神經遞質5-羥色胺耦聯，調節腺苷酸環化酶或磷脂酶C，激活T細胞的蛋白激酶依賴的磷脂酶D途徑，從而產生第二信使來對細胞活動進行調節，和精神分裂、人格以及情感等有密切關系。也有報道[4，5]稱去甲腎上腺素轉運體(Norepinephrine Transporter，NET)作為單胺類遞質，也和人格分裂、攻擊行為、精神障礙有關。研究表明[6]大部分NET需要通過細胞膜上的G蛋白耦聯受體而產生生物學效應。因此本研究選擇和人類情感、行為、認知等功能相關的GNβ3 C825T和NET T182作為候選基因，探討基因多態性和ADHD的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2014年10月～2017年7月在湖北省隨州市某小學募集的286例6～12歲ADHD患兒進行問卷調查，納入標準：(1)符合美國精神障礙診斷與統計手冊第4版(DSM-IV)[7]中ADHD的診斷標準；(2)3代內屬本民族血緣；(3)取得患兒及家屬或法定監護人的同意，并簽署知情同意書。排除標準：患有兒童精神分裂癥、情感障礙、孤獨癥、精神發育遲滯及其他器質性疾病者；家族中有精神疾病患者。所有兒童清水漱口后，采用一次性藥匙對其口腔上皮進行采集，然后置于無水乙醇離心管中保存。其中男童132例，女童154例，平均年齡為(9.2±2.3)歲。

1.2 方法

1.2.1 兒童行為問題測評 采用Achenbach兒童行為量表(Child Behavior Checklist,CBCL)[8]對兒童行為問題進行檢查，行為問題共120項(包括2個由教師自行填寫內容的項目)，按0～2三級評分，包含品行問題、學習問題、心身障礙、多動指數、焦慮抑郁、注意力問題、社會化問題7個方面，將所有單項相加即為行為問題總分。參考蘇林雁等[9]對湖南CBCL常模的研究結果，以常模總分第85百分位作為劃界分，判斷ADHD行為問題發生與否。

1.2.2 基因型分析 采用聚合酶鏈反應(PCR)和限制性片段內切酶法進行基因分析，其中引物設計采用的軟件是primer 5.0，設施后輸入美國國立圖書館數據庫進行引物同源性比較，選出同源性最小且Tm最為合適的作為本研究PCR引物：(1)GNβ3 C825T基因型分析：引物序列：F:5’-TGACCCAACTTGCCACCCGTGC-3’，R:5’-GCAGCAGCCAGGGCTGGC-3’。反應體系為20 μl，加入基因組DNA 50 ng，引物10 pmol，1 U TapDNA聚合酶，2 μl 10×Buffer,2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs。反應條件為：94 ℃下預變性5 min，然后再在94 ℃下繼續變性45 s，在60 ℃下退火30 s，在72 ℃下延伸45 s，共計30個循環，然后72 ℃下延伸10 min。最后將PCR產物中加入5 U的限制性內切酶BseD Ⅰ，然后在55 ℃溫箱中進行消化，時間為3 h，最后在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離，時間為3 h，通過硝酸銀染色觀察各區帶。讀取基因型：野生型(T/T)為342 bp的1條目的帶；純合突變(C/C)為126 bp和216 bp的2條目的帶；雜合突變(T/C)為342 bp、126 bp和216 bp的3條目的帶。(2)NET T182基因型分析：引物序列：F:5’-CTGTTGTGGCTGAAGTGTCGC-3’，R:5’-GGCTCTGCAGGATAAGCATTGAA-3’。反應體系為25 μl，加入基因組60 ng，上下游引物各0.2 μm，2.5 μl的10×Buffer, 2 U TapDNA聚合酶。反應條件：首先在94 ℃下預變性5 min，然后在94 ℃下變性30 s。接著在63 ℃下退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計35個循環，最后在72 ℃下繼續延伸10 min，12%聚丙烯酰胺電泳，時間為3 h，通過硝酸銀染色觀察各區帶。讀取基因型：20 bp和28 bp的2條目的帶為野生型(C/C)；20 bp、28 bp和123 bp的3條目的帶為雜合突變(C/T)；123 bp的l條目的帶為純合突變(T/T)。

1.2.3 統計學方法 數據錄入采用雙核查方式，分析采用軟件SPSS 16.0，對群體數據進行Hardy-Weinberg定律的遺傳平衡吻合度檢驗，通過t檢驗分析基因多態性對ADHD的影響，連續標量的計數資料采用平均值±標準差表示，組間比較采用t檢驗進行分析，采用廣義估計方程模型(Generalized Estimating Equation,GEE)進行多因素分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡的吻合度檢驗 ADHD兒童進行GNβ3 C825T基因型和NET T182基因型Hardy-Weinberg平衡的吻合度檢驗，結果顯示各觀測值和期望值吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。見表1。

表1 GNβ3 C825T和NET T182基因基因型Hardy-Weinberg平衡的吻合度檢驗

2.2 GNβ3 C825T和NET T182基因多態性ADHD患兒CBCL評分比較 GNβ3 C825T基因CT/CC基因型CBCL焦慮抑郁、多動指數評分均高于TT基因型(P<0.05)。NET T182基因CT/CC基因型CBCL焦慮抑郁、社會化問題評分均高于TT基因型(P<0.05)。見表2。

表2 GNβ3 C825T和NET T182基因多態性ADHD患兒CBCL評分比較

2.3 GNβ3 C825T、NET T182與兒童ADHD影響因素的交互作用 文獻報道[8]稱ADHD兒童年齡、性別可能對心理行為存在影響，因此本研究以ADHD兒童行為發生與否作為因變量，將全部樣本的GNβ3 C825T和NET T182基因多態性、性別以及年齡作為自變量進行Logisitic回歸分析，結果顯示GNβ3 C825T和NET T182基因多態性是焦慮抑郁的影響因素(P<0.05)，含C等位基因的個體更容易發生焦慮抑郁行為(P<0.05)。同時GNβ3 C825T基因多態性、性別是多動指數的影響因素(P<0.05)，且在含C基因個體中更容易發生多動行為(P<0.05)，男童比女童更容易發生多動行為(P<0.05)；NET T182基因多態性是社會化問題的影響因素(P<0.05)，且在含C基因個體中更容易發生社會化問題(P<0.05)。見表3、表4。

表3 GNβ3 C825T、性別、年齡與兒童ADHD影響因素的交互作用

表4 NET T182、性別、年齡與兒童ADHD影響因素的交互作用

3 討論

研究表明[10]，編碼G蛋白β3亞基的第10外顯子上存在著C825T基因多態性，這種基因片段異性導致G蛋白β3亞基缺失41個氨基酸，從而產生變異，因G蛋白能夠和80%已知的膜受體和效應器耦聯，因此在擴膜運輸過程中起著極其重要的作用。報道稱[11]，GNβ3 C825T系統功能降低與心理、行為的變化有關。Jiang D等[12]發現，GNβ3 C825T基因與認知功能相關，啟動子區-1438 A/G多態性與抑郁及沖動行為有關。Oakley M等[13]研究發現兒童多動行為的發生與C825T基因多態性存在明顯相關。

本研究結果也顯示ADHD兒童多動指數與C825T基因多態性存在相關性，且GNβ3 C825T基因多態性與性別存在交互作用，男童比女童更容易發生多動行為。兒童階段為了適應現在以及未來社會生活，通過個人與社會的關系在家庭、學校等社會環境中獲得思維、情感以及語言等能力的過程中所出現的問題是社會化問題，社會化問題可以在一定程度上反映兒童和外界溝通能力的強弱，也是兒童樹立價值觀和行為的準繩[14]。研究發現[15]，NET T182在調控人類情感及精神活動中發揮重要作用。另有報道稱[16]，NET T182基因多態性和抑郁癥、自殺觀念、人格存在相關性，而這些也會影響機體與外界的交流。本研究結果顯示NET T182基因中的C基因和社會化問題發生相關，但未發現與多動指數相關。國內學者王含彥等[17]通過Meta分析發現NET T182C基因多態性與抑郁癥的發生之間存在關聯，這可能也是引起兒童溝通能力變弱等社會化行為問題發生的原因。

焦慮抑郁主要是指面對內在想法感受或者外部事件的一種不愉快體驗，嚴重者會發生恐怖、極端等行為[18]。文獻報道[19]稱焦慮和抑郁的產生會受到環境和基因兩方面因素影響，兒童出現焦慮抑郁作為一種情緒表現，是環境和基因共同作用的結果。有學者[20]研究發現人格與人的神經和感知等密切相關，而GNβ3 C825T以及NET T182均和人格存在一定的關聯性，本研究顯示GNβ3 C825T和NET T182的基因多態性與ADHD兒童的焦慮抑郁存在相關。研究發現[21]，在細胞水平上，GNβ3 C825T多態性與Gi介導的信號轉導改變有關，C-T轉換導致跨膜信號轉導和離子轉運活性增強，從而在多種人類疾病中起重要作用。有學者發現[22]，在針對健康人的情緒及生活質量的研究中發現攜帶825T等位基因的抑郁癥患者漢密爾頓抑郁量表評分增高，說明825T等位基因是抑郁的易感因素。NET位于神經末梢突觸前膜，能夠通過促進突觸間隙的去甲腎上腺素(NE)進入突觸前膜，從而阻礙NE與位于突觸后膜的NE受體之間的相互作用，T182C位點的多態性可能影響到NET基因啟動子的轉錄活性[23]，已有的研究表明[24]，NET T182C的等位基因C和基因型CC可能會增加抑郁癥的發病風險，與本研究結果相符。

本研究對GNβ3 C825T和NET T182基因多態性與兒童ADHD相關性進行了分析，但本研究為單中心研究，且樣本量較小，所以研究結果存在一定的局限性。研究發現[25]，GNβ3 C825T和NET T182基因多態性可能與民族、地域有關，且ADHD有多種分型，而GNβ3 C825T和NET T182基因多態性是否與這些因素有關仍有待進一步研究。

綜上所述，GNβ3 C825T和NET T182基因可能是影響兒童行為問題的重要基因，GNβ3 C825T和NET T182與學齡兒童焦慮抑郁問題發生有一定關聯，且NET T182與學齡兒童社會化問題也存在一定關聯。目前，兒童行為問題的生物學證據是近年來研究的熱點，環境和基因相互作用在兒童精神疾病中的作用越來越得到研究的證實。在過去幾年，候選基因DRD4、DRD2、MAOA在兒童行為和人格、抑郁等問題中被廣泛研究，基因和環境的相互作用越來越受到科學家的重視。因此以后研究需要結合更多候選基因，探討基因和基因、基因和環境之間的相互作用。