三氯生對雄斑馬魚鰓抗氧化相關基因表達的影響

郭向萌，鄭芳芳，王凡

（洛陽師范學院生命科學學院，河南 洛陽 471022）

三氯生（Triclosan,TCS）是廣泛應用于化妝品、紡織品、家用清潔劑和消毒劑等中的抗菌劑，大量使用不可避免地釋放到水環境中，在城市排水系統、污水處理系統、污泥、河流等水體中均可檢測到[1-3]。調查發現，雖然TCS 在水環境中分布濃度較低，毒性作用也不明顯，但在一定條件下其可以轉化為毒性更強物質，因此，TCS 的環境行為和毒理學研究受到越來越多的關注[4]。已有研究表明，TCS具有生物蓄積性、通過食物鏈傳遞性和較強的穩定性。TCS 對斑馬魚Danio rerio 和紅白鯽Carassius auratus 血紅細胞微核率和核異常率的顯著影響，表明其對硬骨鯉科魚類具有潛在的遺傳毒性[5,6]；長期的TCS 暴露顯著改變了黃河鯉Cyprinus carpio 性激素和卵黃蛋白原、斑馬魚甲狀腺激素的產生，表明TCS 對魚類具有內分泌干擾效應[7-9]。TCS 能夠不同程度地誘導或抑制劍尾魚Xiphophorus helleri 肝臟相關代謝酶及其mRNA 的表達，表明TCS 對魚類的代謝也產生一定程度的影響[10]。迄今為止，TCS對硬骨魚類抗氧化影響的分子機制研究較少。

斑馬魚是一種與人類基因高度同源，易飼養、繁殖快、生命周期短、對污染物的作用敏感的模式生物，可應用于水質監測、毒理學、藥理學等科學研究中[11]。鰓是魚類直接與水環境接觸的主要呼吸器官，可以更加直接反應出污染物對魚類的毒性作用[12]。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）是生物體內主要的抗氧化酶類。金屬硫蛋白-2（MT-2）和s 金屬硫蛋白-B（sMT-B）清除自由基的能力遠遠超過抗氧化酶類。因此，本研究通過探究TCS 對斑馬魚鰓組織SOD、CAT、GPx、MT-2 和sMT-B 基因表達的影響，有助于揭示TCS 對斑馬魚鰓組織影響的分子機制，可為水生生物保護和維護水生態平衡提供科學依據，為TCS 對動物及人類的潛在危害提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用斑馬魚購自上海誠信漁場，體長為1.5～2.1 cm，選用健康、行為敏捷、規格均勻的個體暫養于60 L 的水族箱中，水量20 L，溫度為（22±3）℃，pH 為（6.9±0.2），連續不間斷充氧。每天投喂兩次，用曝氣72 h 的自來水及時換水，并清理缸內斑馬魚殘餌及糞便，暫養7 d 后開始正式實驗。

試驗用試劑有：三氯生（美國Sigma 公司）、總RNA 極速提取試劑盒（上海飛捷生物技術有限公司）、RNA 反轉錄試劑盒（東洋紡生物科技有限公司）、2×Taq MasterMix（北京康為世紀生物科技有限公司）、GoldView Ⅰ型核酸染色劑、Bestar SybrGreen qPCR mastermix（德國DBI 公司）、二甲基亞砜溶劑（天津紫明化工有限公司）、基因引物（華大基因公司）、瓊脂糖、Loading buffer 染料等。

1.2 方法

資料表明，TCS 對斑馬魚96 h 半致死濃度（LC50）為340 μg·L-1[13]。以此為依據，設置對照和3個TCS 濃度處理組：0 μg·L-1、17.0 μg·L-1、34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1。隨機取暫養后的斑馬魚幼魚100尾，置于各濃度組水族箱中，每組2 個平行。每個水族箱用水量20 L，以半靜態水體暴露法對斑馬魚進行連續處理42 d。整個試驗期間其他條件同暫養。

TCS 處理42 d 后，解剖行動敏捷、生長狀況良好且體表完好的斑馬魚。每個濃度斑馬魚均分為五組，每組取出5 尾斑馬魚鰓，混合樣為一個樣本，取樣后迅速保存在超低溫冰箱中備用。

1.3 凋亡相關基因表達的檢測

1.3.1 引物序列

β-actin（內參）、SOD、GPx1a、CAT、sMT-B 和MT-2 基因的引物序列（表1）來自于相關報道[12,14]。

表1 實時熒光定量PCR 所用基因的特異性引物及其序列Tab.1 Primers and their sequences used for real-time PCR

1.3.2 RNA 的提取與反轉錄

按照總RNA 極速抽提試劑盒提供的方法，提取每個雄斑馬魚的鰓組織混合樣本。對提取出的RNA 用凝膠電泳分析其質量，用超微量分光光度計檢測其純度和濃度。對質量好、純度高且濃度適宜的RNA 樣本進行反轉錄反應。

1.3.3 普通PCR

將反轉錄得到的cDNA、目的基因或內參基因的上下游引物、2×Taq Master Mix 及無菌水制備25 μL 的普通PCR 反應體系。然后，將反應體系充分混勻，根據普通PCR 步驟進行擴增反應。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增情況。

1.3.4 實時熒光定量PCR

為了驗證目的基因（SOD、GPx1a、CAT、sMT-B和MT-2）的擴增效率與內參基因（β-actin）的擴增效率是否滿足實時熒光PCR 相對定量2-ΔΔct法的要求，將上述目的基因引物與內參基因引物同時做標準曲線分析。結果發現：目的基因和內參基因的擴增效率都接近100%，可以用實時熒光定量中的2-ΔΔct法進行目的基因的相對表達量分析。

將反轉錄獲得的樣本的cDNA、目的基因和內參基因的上下游引物、Bestar SybrGreen qPCR mastermix 及無菌水制備20 μL 的實時熒光定量PCR反應體系，充分混勻后，放入實時熒光定量PCR 儀中進行擴增。

1.4 數據分析

分析實時熒光定量PCR 反應后的Cq 值，利用2-ΔΔct法計算目的基因的相對mRNA 表達量，然后應用SPSS13.0 軟件對目的基因的相對mRNA 表達量進行單因素方差分析。數據用X±SD（平均值±標準差）表示，采用LSD 法分析各濃度組和對照組之間的差異，P＜0.05 表示差異顯著；P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 目的基因和內參基因的普通PCR 反應

首先分析每個TCS 濃度組SOD、GPx1a、CAT、sMT-B 和MT-2 基因與內參基因灰度值之比。34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1TCS 濃度組斑馬魚的SOD 基因與內參基因的灰度比明顯下降，表明其表達下調（圖1）。其他目的基因主要表現為：17.0 μg·L-1濃度組GPx1a 基因的表達水平無明顯變化，34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1組表達水平下調；17.0 μg·L-1濃度組CAT 基因的表達水平無明顯變化，34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1濃度組表達水平下調；17.0 μg·L-1濃度組sMT-B 基因的表達水平無明顯變化，34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1濃度組表達水平下調；17.0 μg·L-1濃度組MT-2 基因的表達水平無明顯變化，34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1濃度組表達水平下調（圖1）。

圖1 不同TCS 濃度組斑馬魚鰓基因表達情況Fig.1 Gene expression in gill of zebrafish（Danio rerio）exposed to various concentrations of TCS

2.2 TCS 對雄斑馬魚鰓抗氧化酶相關基因表達定量分析

為了驗證TCS 對斑馬魚鰓的各種抗氧化酶相關基因的表達量的影響，采用RT-qPCR 法檢測并分析處理組的表達與對照之間的差異性。如圖2 所示，SOD、GPx1a 和CAT 基因表達均有下調趨勢。與對照組相比，SOD 基因在34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1濃度組極顯著下調，下調值分別為50.6%和77.7%。GPx1a 基因在68.0 μg·L-1濃度組顯著下調，下調了58.4%。CAT 基因在34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1濃度組極顯著下調（94.1%和90.2%）。

2.3 TCS 對雄性斑馬魚鰓金屬硫蛋白相關基因表達定量分析

金屬硫蛋白相關基因的實時定量分析結果如圖3 所示。由圖3 可知：34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1濃度組斑馬魚的sMT-B 基因表達量極顯著下調，依次下調65.4%和65.4%。MT-2 基因表達量隨著TCS濃度的增加有不同程度的下調，依次下調了95.1%、78.5%和56.7%。

圖2 不同TCS 濃度組斑馬魚鰓抗氧化酶相關基因mRNA 的表達Fig.2 mRNA expression of genes related to antioxidant enzyme in gill of male zebrafish（Danio rerio）exposed to various concentrations of TCS

圖3 不同TCS 濃度組斑馬魚鰓金屬硫蛋白基因mRNA 的表達Fig.3 mRNA expression of metallothionein gene in gill of male zebrafish（Danio rerio）exposed to various concentrations of TCS

3 討論

生物體抗氧化系統與生物的免疫水平密切相關，因此，抗氧化類物質（抗氧化酶類和金屬硫蛋白類）可作為生物體的非特異性免疫指標[15]。SOD、CAT 和GPx 是生物體內主要的抗氧化酶類，在應對外界物理因素和化學因素刺激和清除生物體內自由基中發揮重要作用。MT-2 和sMT-B 是生物體內普遍存在的兩種典型代表性的金屬硫蛋白，清除自由基的能力遠超過抗氧化酶類。因此本實驗研究了TCS 對斑馬魚鰓SOD、GPx1a、CAT、sMT-B 和MT-2基因mRNA 表達的影響。

SOD 基因表達產物為超氧化物歧化酶，能催化超氧化物陰離子自由基，且歧化為過氧化氫（H2O2）與O2，保護細胞免受氧自由基氧化損傷[16]。CAT 是過氧化體中存在的氧化酶，主要將H2O2分解為H2O和O2,即將H2O2及其他過氧化物轉變為無毒性產物[17]。GPx 基因表達產物為谷胱甘肽過氧化物酶，通過還原性谷胱甘肽催化還原過氧化物和有機H2O2，保護細胞和其他如DNA、蛋白質及脂質體等敏感生物分子免受氧自由基損傷[18]。GPx1a 是GPx 家族成員之一，能清除過氧化氫和脂肪酸過氧化氫[19]。本研究發現，暴露在34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1濃度的TCS溶液42 d 后，斑馬魚鰓組織SOD 基因和CAT 基因的表達顯著下調，表明該濃度TCS 刺激了斑馬魚鰓組織，使超氧化物陰離子自由基增多，而此時SOD要迅速清除過多的超氧陰離子自由基，SOD 基因表達下調，在清除過多的超氧陰離子自由基的同時會導致H2O2和其他的過氧化物迅速增多，CAT 要催化過剩的H2O2和過氧化物也會致使CAT 基因表達量降低。本研究也發現，34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1濃度組GPx1a 的表達量在下調，且在68.0 μg·L-1濃度組顯著下調，進一步證實了H2O2和其他的過氧化物在鰓組織中過剩，致使鰓組織氧化系統和抗氧化系統失衡，造成對鰓組織的氧化性損傷。已有研究報道，HgCl2能使斑馬魚SOD 基因表達下調[20]，全氟辛烷磺酸類物質可使劍尾魚SOD 基因表達下調[21]；鉻使草魚Ctenopharyngodon idellus 鰓內GPx 活性先增高后降低，且長時間暴露會導致GPx 基因表達降低[22]；懸浮物使褐牙鲆Paralichthys olivaceus 幼魚CAT 基因表達顯著下調[23]；底泥浸出液使脊尾白蝦Exopalaemon carinicauda CAT 酶活力及基因表達下調[24]。這些研究結果和本研究結果一致。

MT-2 基因表達產物為金屬硫蛋白-2，其為富含半胱氨酸的短肽，能與機體氧自由基反應，清除游離活性氧，來保護細胞防止氧化性損傷[25]。因此，當體內金屬硫蛋白表達量降低，清除體內氧自由基的效率降低，造成細胞的氧化損傷。本研究發現，在TCS 各處理組中MT-2 基因表達極顯著下調，表明MT-2 比抗氧化酶更為敏感，也證實了中濃度組和高濃度組的TCS 已經使斑馬魚鰓各類氧自由基過剩，造成鰓內的氧化體系與抗氧化體系失衡，斑馬魚鰓產生了氧化性損傷。但尤日福等[26]和王磊等[27]的研究表明，鎘使河蚌Anodonta woodiana 和泥鰍Misgurnus anguillicaudatus 金屬硫蛋白基因表達顯著升高，其原因可能是他們的研究中使用的污染物濃度過小或者暴露時間過短，而本實驗中斑馬魚暴露時長達42 d，長時間脅迫已經致使魚體內氧化系統和抗氧化系統失衡。sMT-B 也能清除生物體內氧自由基，減輕氧化性損傷，同時與腦神經的一些生理功能也有一定關系[14]。本次研究發現，TCS 濃度為34.0 μg·L-1和68.0 μg·L-1時，sMT-B 基因的表達極顯著降低，進一步證實上述結果的可靠性。

綜上所述，TCS 對雄性斑馬魚鰓組織的抗氧化基因表達造成一定影響，引起SOD、GPx1a、CAT、sMT-B 和MT-2 等基因表達量降低，體內的氧自由基不能被有效清除，產生氧化性損傷，這將有助于揭示TCS 對斑馬魚影響的分子機制。