魚類原始生殖細胞標記基因研究進展

程琳 ，黃天晴，劉晨斌，谷偉，徐革鋒，史秀蘭，姚作春，王麗薇，王炳謙

（1.哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150025;2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

魚類早期胚胎發育階段生殖細胞系與體細胞系發生分離，隨后形成原始生殖細胞（primordial germ cells,PGCs）。PGCs 起源于胚胎外，通過胚胎組織遷移到生殖嵴，分化為精原細胞或卵原細胞，進一步發育成卵母細胞和精母細胞，最終形成成熟卵子和精子[1]，是配子在胚胎中的前體。精子與卵子結合后將遺傳信息傳遞給下一代，以保證物種延續和進化[2]。作為親本與后代之間的聯系，研究魚類PGCs 發育及遷移對遺傳資源保護、性別控制和水產養殖具有重要意義，也為研究其他生物提供了機制線索和模型[3,4]。生殖細胞具有特定的基因表達模式，脊椎動物的一些基因在PGCs 中特異表達，如Vasa，Dead end（dnd）和Nanos3 等，越來越多的研究以這些基因為標記來研究PGCs 的遷移和發育。

1 魚類PGCs 的起源及形成機制

受精卵的細胞質中存在一些由特殊mRNA 和蛋白組成的細胞質決定因子，即生殖質（germ plasm），隨著胚胎發育及細胞分裂，生殖質被不對稱地分配到細胞中，含有生殖質的細胞將分化為PGCs[1]。生殖質為生殖細胞的發源地，決定PGCs 的形成及發育[5]。最開始由于缺乏PGCs 標記，只能利用光學和電子顯微鏡簡單地鑒定PGCs 的形態特征。形態學研究表明，PGCs 一般為梨形、圓形或橢圓形，比體細胞大（直徑通常為10～12 μm），細胞直徑因不同種屬及發育時期差異較大；核質分界明顯，細胞核較大（一般為6～10 μm），位于細胞一側，常呈圓形或分葉狀，核膜清晰，核仁較明顯（一般1～2 個）[6]。超微結構表明，PGCs 具有與線粒體相關的電子致密物。Nedelea 等[7]在鯉Cyprinus carpio PGCs 胞質中最早發現該物質。劉少軍[8]將革胡子鲇Clarias lazera PGCs 中的這種電子致密物稱為生殖質。這種結構不僅能儲存PGCs 分化及發育所需的RNA 和蛋白質，在生殖系發育中發揮關鍵作用，還可能參與調節生殖系的轉錄及翻譯[9,10]。有些魚類的PGCs 中還有卵黃塊，在胚胎發育早期為PGCs 提供營養物質[8]。在遷移期間，PGCs 中還常見絲狀偽足或葉狀偽足[11]。

不同種屬魚類的PGCs 起源不同，大致可分為兩種：一種起源于內胚層，如中華鱘Acipenser sinensis、虹鱒Oncorhynchus mykiss、大麻哈魚Oncorhynchus keta、泰山螭霖魚Varicorhinus macrolepis、革胡子鲇和黑尾近紅鲌Ancherythroculter nigrocauda 等，都在原腸早期內胚層中鑒別出PGCs[12]；另一種起源于中胚層，如普氏七鰓鰻Entosphennus wilderi 和泥鰍Misgurnus anguillicaudatus[11]。

隨著斑馬魚Danio rerio PGCs 中特異表達基因Vasa 的出現，魚類PGCs 研究取得了長足進展[13]。Vasa RNA 在早期卵裂胚胎中被定位到32 細胞期的4 個細胞中。這4 個細胞隨后分化為PGCs，表明在胚胎發育早期斑馬魚的生殖細胞與體細胞就已經發生分離，在原腸期進入內胚層后PGCs 數量保持不變并開始積極遷移到形成性腺的部位[14]。之后在大西洋鱈Gadus morhua、大西洋鮭Salmo salar、大菱鲆Scophthalmus maximus、鯉、金魚Carassius auratus 和泥鰍等中發現了與斑馬魚具有相似的PGCs形成模式，稱為先成論[15]。PGCs 還有一種形成方式稱為后成論，該觀點認為，生殖細胞是由體細胞周圍組織誘導分化而來，在發育晚期才能鑒定出生殖細胞，如青鳉Oryzias latipes Vasa RNA 在卵裂期胚胎細胞中廣泛分布，直到原腸晚期PGCs 中才鑒定出Vasa 基因[16]，虹鱒、真鯛Pagrosomus major 的PGCs形成模式與青鳉相似[15]。

對斑馬魚和青鳉PGCs 遷移方式的研究比較系統和深入。目前認為有3 種方式遷移至生殖嵴：通過臟壁中胚層到達腸系膜，再遷移至生殖嵴；通過體節遷移沿體壁中胚層到達生殖嵴；最后一種為借助血液循環遷移至生殖嵴[17]。斑馬魚在囊胚期時，PGCs 開始從非運動模式轉變為運動模式[18]。在體細胞發生后期，PGCs 位于腸道周圍，被中胚層體細胞包圍，通過腸道和腸系膜的中胚層從體細胞附近開始遷移[19]。在體節發育階段，PGCs 位于外側中胚層，呈兩條線性分布，隨后這些細胞沿著背-腹軸向軀干腹部遷移，然后聚集在原始生殖嵴中[20]。魚類PGCs 在遷移中除自身獨特性外，還具有主動及被動遷移能力，如有些魚類PGCs 表面觀察到偽足形成，認為這是PGCs 主動遷移的標志；一些PGCs在遷移過程中受到周圍組織細胞推動而被動遷移[21]。

2 魚類PGCs 標記基因

在許多物種中已鑒定的生殖質是一些保守的RNA 結合蛋白或編碼這些蛋白的mRNA，對生殖細胞的命運至關重要。已生殖細胞中發現的特異表達基因，如Vasa、Nanos、Dead end（dnd）、bucky ball、Ca15a、sdf1 和Dazl，可用作PGCs 特異分子標記。研究這些基因的功能具有理論意義，對魚類生殖細胞操作技術及相關應用研究，如生殖細胞生物學、遺傳資源保護、性別控制等具有潛在的應用價值。本文綜述了幾種常見標記基因的研究進展，為了解魚類標記基因提供借鑒。

2.1 Vasa 基因

Vasa 基因（也稱為Ddx4）是DEAD-box（Asp-Glu-Ala-Asp）蛋白家族的重要成員，參與RNA 編輯、mRNA 啟動、rRNA 加工、翻譯起始、核mRNA 輸出以及mRNA 降解等過程[22]。在大多數魚類中，僅在生殖細胞系中檢測到Vasa 基因雜交信號。該基因為生殖細胞形成和配子發生所必需，被作為優良分子標記廣泛用于魚類PGCs 的起源、遷移、分化及性腺和配子發生等研究中[23]。目前，已在許多魚類中成功克隆得到其同源基因，如斑馬魚[13]、虹鱒[24]、羅非魚Oreochromis spp[25]、青鳉[16]、異育銀鯽Carassius auratus gibelio[26]、黃鱔Monopterus albus[27]、牙鲆Paralichthys olivaceus[28]、草魚Ctenopharyngodon idellus[29]、鱸Dicentrarchus labrax[30]、大菱鲆[31]、大西洋鱈[32]、七彩神仙魚Symphysodon haraldi[33]、半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis Gunther[20]、革胡子鯰[34]、南方鱸Silurus meridionalis[35]、石首魚Totoaba macdonaldi[36]、金魚[37]、翹嘴紅鲌[38]和真鯛Pagrus major[39]等。

Vasa 基因由Schüpbach 等于1986 年首次在黑腹果蠅Drosophila melanogaster 中發現，證實其為生殖質的前體，具有母源遺傳效應。該基因發生突變會導致生殖細胞無法正常形成[40]。Vasa 亞族蛋白具有DEAD-box 家族典型的8 個保守結構域（圖1）[41]，AXXXGKT 和DEAD 分別為ATP 酶A-motif 和ATP酶B-motif 結合域，A 區域為ATP 結合位點，B 區域為ATP 水解部位。SAT 保守結構域也是ATP 結合位點，GRIGRXXR 與其他幾個結構域可能間接參與RNA 結合及解旋活動[42]。鋅指結構（CCHC 框）為Vasa 蛋白特有結構，該結構可能與核酸結合有關，也可能與靶RNA 分子特異性相關。大多數Vasa 蛋白的N 末端存在甘氨酸富集區（G-rich region）和多個RGG（arginine-glycine-glycine）重復序列。N 末端起始密碼子及C 末端終止密碼子附近有Vasa 保守結構常見的色氨酸（W）殘基，有些Vasa 蛋白還具有ARKF 框、GXVGXA 框及位于C 末端的EXEEXW框[43]。

研究表明，七彩神仙魚從受精卵開始Vasa 基因即穩定表達，一直到出膜期，均檢測到表達信號，到囊胚期時含量達最大，隨后逐漸降低[33]。羅非魚和青鳉早期胚胎中，到原腸早期Vasa mRNA 均高表達，原腸期時開始下降，呈低表達[16,25]。這些研究均證實：Vasa 基因是母源性表達基因，Vasa 在PGCs中特異性表達，隨著胚胎發育，直到出膜之前，體細胞開始大量分裂，數量逐漸增加，此時與體細胞相比，生殖細胞占總細胞數減少，Vasa 基因的表達量降低。在斑馬魚胚胎第一次和第二次卵裂溝末端檢測到Vasa 信號，信號逐漸遷移到囊胚期的四個卵裂球中，隨后卵裂球分化成PGCs，在囊胚期結束之前，PGCs 中富集大量Vasa mRNA 和合子Vasa 轉錄物。隨著胚胎發育，母源性Vasa mRNA 逐漸在生殖質附近聚集，這證實Vasa mRNA 是組成斑馬魚生殖質的重要成分[13]。

孫冬捷等[44]研究發現，Vasa 基因在斑馬魚不同發育期生殖細胞中特異性表達，整個發育階段的表達量先上升再下降；同一發育期，精巢與卵巢中Vasa 基因表達量基本一致，卵巢略高于精巢。七彩神仙魚各發育期卵巢中Vasa 基因的表達量均高于精巢[33]，繁殖前的精巢中含有大量的精子，但檢測到的Vasa 基因表達量卻低于繁殖后期，這也進一步證實Vasa 為母源性基因。

圖1 Vasa 蛋白8 個保守結構域[41]Fig.1 Eight conserved motifs in Vasa protein[41]

魚類Vasa mRNA 在精子和卵子發生中的表達模式不同。在卵子發生過程中，Vasa 基因在卵原細胞中雜交信號較弱，在I、II 期的卵母細胞中雜交信號較強，在III、IV 期卵母細胞中又急劇減弱，但外周皮層區域陽性信號仍較強，呈現低高低的表達模式[20,37]。不同魚類精子發生過程一般也不同。Kobayashi 等[25]研究顯示：羅非魚Vasa 基因在精原細胞中大量表達，初級精母細胞中表達下降，胞質中的雜交信號均勻且強烈，在次級精母細胞、精子細胞和成熟精子中則沒有雜交信號，這一模式與金魚、青鳉等相似；Vasa 基因在異育銀鯽精原細胞中表達量低，但在初級精母細胞中大量表達，精細胞和精子中信號較低或檢測不到，此結果與七彩神仙魚、半滑舌鰨和革胡子鯰等結果相似[26]。

雖然Vasa mRNA 在卵子和精子發生過程中表達模式不同，但Vasa 基因信號均在配子發生前期較強，后期較弱或不表達。這證實Vasa 基因對早期生殖細胞產生、分化及發育過程中發揮重要作用。在一些報道中，Vasa 基因mRNA 的表達不止局限于生殖細胞，其他組織中也有表達，如青鳉腦、軀干和尾部[45]；虹鱒心臟和腦部[24]及半滑舌鰨的心臟[46]都曾報道過Vasa mRNA 的低量表達，這說明Vasa 對體細胞的發育也有一定作用。

2.2 Dnd 基因

Dead end（Dnd）是Gilbert Weidinger 等2003 年首次在斑馬魚中發現并被分離出來。該基因能編碼RNA 結合蛋白，是組成生殖質的重要成分，在生殖質及PGCs 中特異表達，對PGCs 存活和遷移至關重要[10,47]。Dnd 在進化上很保守，其基因編碼的蛋白包含一個保守的RNA 識別基序（RRM）和五個保守結構域（圖2）[48]，其中RRM為主要的功能區域。五個保守結構域包括N 末端區域（NR）和四個C 末端區域[49]。Dnd 蛋白位于斑馬魚PGCs 核周的生殖質顆粒中，在核周區域的亞細胞定位與RRM有關，若RRM突變將導致Dnd 無法從核中區域轉移到生殖質顆粒中，導致其功能喪失；雖然在亞細胞定位中Dnd 蛋白的C 端不起主要作用，但若其發生突變也會顯著影響Dnd 功能[50]。Dnd 基因還具有特殊的穩定結構（3’非翻譯區即3’UTR）。這種穩定依賴于mRNA 與某些蛋白質的相互作用，如Dnd-1，保護它們免受miRNA 介導的抑制，如斑馬魚Dnd 蛋白可與生殖系基因Nanos1 和tdrd7 的3’UTR 結合，防止miR-430b 復合物介導的RNA 將這兩種基因降解[51]。最新的研究表明：斑馬魚Dnd 蛋白的C 末端具有ATPase 活性，這種活性對于PGCs 的存活至關重要，且C 端突變將導致PGCs 數量減少[52]。Dnd基因對偽足的形成和穩定也有很大關系[10]，敲除Dnd導致PGCs 錯誤遷移，斑馬魚不育[50]。

目前，在斑馬魚[10]、青鳉[53]、泥鰍[54]、金魚[55]、尼羅羅非魚[56]、大黃魚Pseudosciaena crocea[47]、斯特拉鱘[57]、中華鱘[58]、大西洋鮭[59]、大菱鲆[60]、真鯛Pagrus major[61]、大西洋鱈[62]、牙鲆[63]、稀有鮈鯽Gobiocypris rarus[64]和半滑舌鰨[20]等魚類中都成功克隆了Dnd同源基因。

Dnd 基因翻譯受阻可完全抑制PGCs 在早期胚胎發生過程中的遷移和發育；Dnd 的缺失會導致PGCs 功能喪失[63]。方玲玲等[65]研究表明：敲除Dnd基因導致尼羅羅非魚性腺中缺失生殖細胞，隨著胚胎發育，雄性精巢中僅存在大量體細胞；精巢中還出現大量空腔，無法形成正常的配子。敲除大西洋鱈魚Dnd 基因導致PGCs 相關基因mRNA 表達量降低。抑制泥鰍Dnd 基因導致生殖細胞消失，形成無生殖細胞的雄性個體[54]。Dnd 基因對mRNA 還具有保護作用，如斑馬魚PGCs 中，Dnd 可以通過與富含尿嘧啶區域的靶mRNAs（URRS）結合，阻礙一些短片段非編碼的單鏈小RNA（miRNAs）對靶mRNA的降解[66]。

在早期胚胎發育中，青鳉Dnd 基因一直處于較高水平，直到桑葚胚階段明顯下降，且僅在性腺中高表達。原位雜交結果表明：青鳉卵巢中的卵原細胞和早期卵母細胞中Dnd 信號強烈。睪丸周圍精原細胞信號強，初級和次級精母細胞中減弱，但在精子中卻很難檢測到。因此，也將Dnd mRNA 作為雄性青鳉生殖細胞在減數分裂前期和后期的標記物[48]。桂建芳等[67]用Dnd 特異性寡聚核苷酸介導的敲除方法，建立了一個完整的生殖細胞衰竭性腺模型，揭示了銀鯽雌核發育中所有雌魚原始生殖細胞的完全缺失，改變了性別偏向基因的表達，發生不育雄性。上述結果表明：異育銀鯽Dnd 轉錄物能成為配子發生不同階段的極好標記，也是追蹤胚胎發育過程中PGC 遷移的有用標記[53]。Lin 等[60]發現，大菱鲆Dnd 基因發生模式與斑馬魚似，僅在生殖細胞中特異性表達，并呈現明顯的性別二態性，推測Dnd 基因可能參與大菱鲆性別分化過程。

圖2 Dnd 結構簡圖[48]Fig.2 The structure diagram of Dnd protein[48]

2.3 Nanos 基因

Nanos 基因最先在果蠅中發現，是一種母源效應基因，能夠編碼一種RNA 結合蛋白，與Pumilio RNA 結合蛋白相互作用形成核蛋白復合物，共同抑制母源hunchback mRNA 的翻譯，調控果蠅胚胎后腹部細胞的分化，其編碼的蛋白是組成生殖質的重要成分[68,69]。Nanos C 端有兩個為翻譯調控所必需的特異Cys-Cys-His-Cys（CCHC）鋅指基序[70]，缺失或突變都使Nanos 失去功能。Nanos 參與PGCs 的遷移和維持，為生殖干細胞自我更新和生殖細胞發育所必需，突變會導致性腺中極細胞無法正常遷移，且無法形成生殖細胞，并造成胚胎大量死亡[71]。如果蠅缺失Nanos 基因將不能形成腹部，形成的極細胞不能準確遷移，分化出的生殖細胞不具有正常功能并最終發生凋亡[72]。

目前，已鑒定出的Nanos 同源基因有三種：Nanos1、Nanos2 和Nanos3。這三種Nanos 同系物在不同物種中的功能不同。秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans 含有三個Nanos 同源基因，Nanos1 和Nanos2 對PGCs 有調節作用，單獨缺失時，多數生殖細胞都能正常發育，但同時缺失則導致線蟲不孕；Nanos3 與FBF-1 能調節雌雄同體線蟲精子和卵子發生的轉換點[73]。小鼠的Nanos1 在中樞神經系統、成體大腦和睪丸輸精管中均有高表達，但在生殖細胞發育過程中沒有表達。缺乏Nanos1 的小鼠并未表現出異常，表明Nanos1 對小鼠性腺發育并非必需[74]。據報道，Nanos2 只在雄性細胞中表達，敲除其導致成年睪丸中精原細胞丟失，因此將Nanos2 作為雄性生殖細胞的特異性標記，調控小鼠的性別決定[75]。Nanos3 在兩性生殖細胞中均有表達，敲除Nanos3 會導致PGCs 在遷移過程中凋亡[76]。

對魚類Nanos 的研究還不多，目前僅在斑馬魚、青鳉、日本鰻鱺Anguilla japonica、泥鰍、牙鲆、金魚、鯡Clupea pallasi、大黃魚、蝦虎魚Gobiidae、黑脊倒刺鲃Spinibarbus caldwell、白氏文昌魚、中華鱘、團頭魴Megalobrama amblycephala 等魚類中有過報道[77-79]。Koprunner 等[80]以Nanos 為標記基因，向缺失母源Nanos 的斑馬魚細胞胚胎注射Nanos3′UTR mRNA，證實了Nanos 是斑馬魚PGCs 遷移和成活所必需的基因。隨后Draper 等[81]證實，Nanos對維持成體斑馬魚卵巢產生卵母細胞至關重要。青鳉的Nanos1 有兩種亞型Nanos1a 和Nanos1b，Nanos1a 在卵母細胞和精子細胞周圍的體細胞中表達，但Nanos1b 不表達。在成年卵巢和精原細胞僅有Nanos2 表達，但在性腺分化早期未發現該信號。Nanos3 在早期胚胎發生和成體青鳉雌性卵母細胞遷移的PGCs 中有所表達，因此，一般選用Nanos3標記PGCs[82]。Hitomi 等[83]發現，在胚胎發育過程中Nanos3 在體細胞和PGCs 中都能被轉錄，但只在PGCs 中被翻譯，這與其3’UTR 密切相關，3’UTR區域的翻譯調控元件（TCE）和微小元件能調控細胞特異性表達。向青鳉中注射GFP-半滑舌鰨Nanos 3′UTR mRNA，能夠標記胚胎發育過程中的PGCs，這也證實了Nanos3 可作為魚類PGCs 的理想標記基因[20]。

Nanos 基因在半滑舌鰨性腺中高表達；在精巢中的表達量高于卵巢，在其他組織中，腦和肝臟的表達量相對較高。原位雜交結果表明，半滑舌鰨Nanos mRNA 在卵巢中卵子發育I 期、II 期信號較強，之后逐漸減弱；在精巢中，主要在與精子形成相關細胞中高表達，其他細胞中未檢測到信號，為典型的性別二態性表達[20]。Nanos 基因在黑脊倒刺鲃生殖細胞發生早期起重要作用，在后期作用并不是很大[84]。

比對發現，不同魚類Nanos3 3’UTR 序列差異很大。在斑馬魚、羅非魚等少數魚類的3’UTR 中發現了識別結合miR430 促進RNA 降解的序列GCACUU。該序列附近存在U-rich 區域。研究發現，斑馬魚的Dnd 蛋白能夠與Nanos3 3’UTR 的U-rich區域結合，抑制miR 430 與3’UTR 的結合，從而抑制PGCs 中Nanos mRNA 的降解[10]。朱林等[85]對團頭魴的研究也證實這一點。團頭魴Nanos3 3’UTR中存在一個非經典的miR430 識別位點（GCACTA）。該位點突變可影響Nanos3 3’UTR 對斑馬魚PGCs 的標記效率，證實其有利于Nanos3 在非PGCs組織中的降解。目前，關于Nanos3 3’UTR 的多變性了解的還很不透徹，還需要在其他硬骨魚中進行相關研究。

3 小結

隨著分離鑒定出的魚類原始生殖細胞標記基因的增多，對PGCs 的研究也日益透徹。了解生殖細胞分化和配子發生過程中基因表達的變化，不僅為研究PGCs 不同發育階段生殖細胞起源、遷移和分離奠定基礎，也為魚類的應用研究提供了理論支持。盡管對這些基因有了一定的了解和應用，但在很多方面都不成系統，對其功能的認識也只通過敲除、RNA 干擾及轉基因等方式進行推測，對這些基因的研究也僅局限于生殖細胞，幾乎沒有在非生殖細胞中進行功能研究。因此，對這些魚類標記基因的研究有著非常廣泛的空間，可以在更多魚類中發掘更多標記基因。隨著RNA 定點表達（localized RNA expression,LRE）技術的廣泛應用，更加明了對些標記基因在魚類體內的調控機理，對魚類生殖細胞研究及繁殖育種都有極大的幫助，對于生殖細胞體外培養和移植、瀕危魚類的保護和利用以及魚類生殖發育生物學的研究都具有重要意義。