pH 對蒙古鲌肝胰臟和腸道中消化酶活性的影響

韓慶，龔麗軍，凌卯梅，趙莉，謝中國，楊品紅

（湖南文理學院生命與環境科學學院，湖南 常德 415000）

蒙古鲌Culter mongolicus Basilewsky（又稱紅梢子）是鯉形目、鯉科、鲌亞科、鲌屬的一種經濟魚，一般生活在水流緩慢的水域中[1]。近年來，對鲌類的生物學特性[2]、人工繁殖[3]、消化酶活性等已有相應的研究，對蒙古鲌的食性[4]、漁藥對蒙古鲌的毒性[5]、消化酶活性[6]等方面做出了論述。有關魚類消化酶的研究較多[7-12]。不同種魚類及同種魚消化道不同部位的消化酶種類都不盡相同；各種消化酶在機體生理狀態和病變時的活性不同，因而最適pH 也有一定差異[13]。研究魚類消化酶活性、揭示不同食物在魚類體內的消化利用，可為人工飼料的開發提供參考[14]，也可為分析環境因素對魚類食性的影響和鑒定不同種屬魚類提供一定的資料。本試驗采用考馬斯亮藍法和分光光度法研究了常德皂市水庫蒙古鲌肝胰臟和腸道消化酶的活性，為蒙古鲌的養殖和合理搭配飼料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

蒙古鲌6 尾，體質量0.12～0.15 kg，體長20.30～21.80 cm，由拖網捕自常德皂市水庫。

試驗用儀器和藥品有：722s 型可見光光度計（上海昂拉儀器有限公司）、高速冷凍離心機（5417R）、千分之一電子天平（TX233L，北京賽多利斯儀器系統有限公司）、制冰機（AF-100）、紫外分光光度計（UVmini-1240，上海青華科技儀器有限公司）、冰箱（海爾BCD-215SJV）和恒溫水浴鍋（HWS26）等。

0.2mol/L 磷酸氫二鈉（分析純）、0.1mol/L 檸檬酸（分析純）、酪蛋白（分析純）、HCl、可溶性淀粉（分析純）、甘油三脂、乙醚、碘、碘化鉀（分析純）、濃鹽酸、考馬斯亮藍、雙蒸水。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

試驗魚捕出饑餓36 h 后，在冰盤上迅速解剖，取出肝臟和腸道，去除脂肪，剖開腸道，用預冷的生理鹽水（0～4 ℃）洗兩次，再用濾紙吸掉表面的水分，將腸道切分成前腸、中腸和后腸（第1 個回折點以前為前腸，最后1 個回折點以后為后腸，其間為中腸）[14]3 個部分，分別稱重。按1∶20（w/v）的比例加入預冷的緩沖液，迅速勻漿后將勻漿液轉入1.5 mL的離心管中，0～4℃下12 000 r/min 的轉速下高速冷凍離心20 min，取上清液作為粗酶液，置于-20 ℃冰箱中冷凍保存備用。

1.2.2 pH 梯度的設計

以0.2 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液作為pH 調節劑，以0.4 為幅度，在6.2～7.8 之間設置5 個pH 梯度，即：6.2、6.6、7.0、7.4、7.8。

1.2.3 酶活力測定

蛋白酶活力測定：參照黃耀桐的方法[15]，采用考馬斯亮藍染色法測定，取1%酪蛋白溶液0.4 mL與1 mL 酶液混勻加入適量緩沖液調節至相應pH后，于30℃水浴鍋中反應30 min，再放入沸水中加熱5 min，使酶失活，加入3 mL 考馬斯亮藍染色液染色20 min，于595 nm 處測定吸光值。在30℃每min 分解1μg 酪蛋白所需的酶量定義為一個蛋白酶活力單位（IU/g）。總酶活定義為：該新鮮組織中總的活力單位數，與該組織的比活力及組織重量成正相關。淀粉酶、脂肪酶總酶活定義同此。

淀粉酶活力測定：參照吳莉芳的方法[16]，取0.4 mg/mL 淀粉底物緩沖液0.05 mL 于試管內，30 ℃水浴預熱，加入2 mL 酶液混勻，再加入適量緩沖液調節至相應pH 后，反應15 min，在660 nm 處測定吸光度。30 ℃每min 分解1 μg 淀粉所需的酶量為一個淀粉酶的活力單位（IU/g）。

脂肪酶活力測定：參照黃小燕的方法[17]，在試管中加入460 μmol/L 的甘油三脂4 mL，在30 ℃水浴預熱5 min，加0.025 mL 酶液，再加入適量緩沖液調節至相應pH 搖勻（切勿用力震蕩）后倒入比色皿，在420 nm 處測定吸收值（A1），再快速將比色液倒回原試管中，置于30 ℃水浴鍋中水浴10 min 再次測定吸光度（A2）。以每min 催化產生1 mg 脂肪的酶量為1 個脂肪酶的活力單位（IU/g）。

1.3 數據處理與分析

數據以測定的6 個樣本的平均值表示，并用Excel 對數據進行整理，用SPSS17.0 進行方差分析及差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 蒙古鲌的蛋白酶活力

不同pH 和pH7.4 時，蒙古鲌消化道各部位蛋白酶活力見圖1 和圖2。由圖1 及圖2 可知：蒙古鲌4 種部位中蛋白酶活力大小由高到底依次為：前腸、肝胰臟、中腸、后腸，分別為（236.65±6.56）IU/g、（167.13±5.79）IU/g、（62.64±2.41）IU/g、（47.10±2.02）IU/g；總酶活由大到小依次為：肝胰臟、前腸、中腸、后腸，分別為1556.15 IU/g、1289.53 IU/g、92.25 IU/g、51.93 IU/g。蒙古鲌消化道不同部位的蛋白酶活力均在pH 為7.4 時最高；在pH 6.2～7.8 之間呈先上升再下降的趨勢，肝胰臟、前腸蛋白酶活性在不同pH 下差異明顯（P＜0.05）；同一pH，肝胰臟、前腸與中、后腸蛋白酶活性差異性顯著（P＜0.05），肝胰臟和前腸間、中腸和后腸間差異不顯著（P＞0.05）。在pH7.4 時，消化道各部位之間的蛋白酶活性差異顯著（P＜0.05），肝胰臟總酶活力高于中、后腸且差異性極顯著（P＜0.01）。

圖1 在不同pH 下蒙古鲌肝胰臟和腸中蛋白酶活力Fig.1 The protease activity in hepatopancreas and intestine exposed to pH values of 6.2,6.6,7.0,7.4 and 7.8 in culter Culter mongolicus

圖2 pH7.4 時蒙古鲌肝胰臟和腸中蛋白酶活性變化Fig.2 The protease activity（IU/g）in hepatopancreas and intestine exposed to pH 7.4 in culter Culter mongolicus

Dasketal[18]研究發現，蛋白酶原主要由肝胰臟分泌。本試驗中，蒙古鲌肝胰臟蛋白酶總酶活比腸道各部分都高，說明肝胰臟是分泌蛋白酶的主要組織。魚蛋白酶原的蛋白酶活性很小，主要由肝胰臟分泌，而這種酶原到達腸道被腸激酶激活后，表現出較大的生物活性[19]。蒙古鲌的肝胰臟分泌的蛋白酶本身具有較大的活性。由此可知，蒙古鲌的前腸和肝胰臟在蛋白質消化中起主要作用，其中，前腸蛋白酶活性最強，但肝胰臟在消化器官中所占的比例大于前腸，故肝臟的總酶活大于前腸。

2.2 蒙古鲌淀粉酶活力

不同pH 和pH7.4 時蒙古鲌淀粉酶的活力見圖3 和4。由圖3、圖4 可知，蒙古鲌消化器官不同部位中淀粉酶比活力由強到弱依次為：肝胰臟、前腸、中腸、后腸，分別為（12.34±2.21）IU/g、（3.17±0.65）IU/g、（2.59±0.36）IU/g 和（2.28±0.30）IU/g；總酶活由高至低依次為：肝胰臟、前腸、中腸、后腸，分別為114.89 IU/g、17.27 IU/g、3.98 IU/g 和2.51 IU/g。蒙古鲌消化道各部位的淀粉酶活力在pH7.4 時最高，在pH6.2～7.8 之間各部位的淀粉酶活力呈先上升再下降的趨勢，同一部位的淀粉酶活性在不同pH 下無顯著差異（P＞0.05），肝胰臟淀粉酶活性高于腸道各部位，且差異極顯著（P＜0.01），腸道各部位之間的淀粉酶活性無顯著差異（P＞0.05）。在pH7.4 時，肝胰臟與腸道各部位的淀粉酶總酶活差異極顯著（P＜0.01）。肝胰臟中的總酶活遠高于腸道可能是肝胰臟是淀粉酶生成的中心器官，不需要被進一步激活就已經具有較強的活性，其分泌能力的強弱也對消化食物中的淀粉具有一定的作用。

圖3 在不同pH 下蒙古鲌肝胰臟和腸中淀粉酶活力Fig.3 The amylase activity in hepatopancreas and intestine exposed to various pH values in culter Culter mongolicus

圖4 pH7.4 時蒙古鲌肝胰臟和腸中淀粉酶的活性Fig.4 The amylase activity（IU/g）in hepatopancreas and intestine exposed to pH 7.4 in culter Culter mongolicus

2.3 蒙古鲌脂肪酶活力

不同pH 和pH7.4 時蒙古鲌腸和肝胰臟脂肪酶的活力見圖5 和圖6。由圖5 和圖6 可知，蒙古鲌消化器官不同部位中脂肪酶活力大小由高到低依次為：肝胰臟、前腸、中腸、后腸，分別為（186.74±2.98）IU/g、（51.51±1.93）IU/g、（37.69±1.65）IU/g 和（17.28±0.82）IU/g；總酶活由高到低依次為：肝胰臟、前腸、中腸、后腸，分別為1378.11IU/g、280.62 IU/g、57.94 IU/g 和19.08 IU/g。在pH 7.4 時，蒙古鲌消化道各部位的脂肪酶比活力最高，在設定的pH范圍內各部位脂肪酶活力均先上升再下降，腸道中脂肪酶活性在不同pH 下無差異（P＞0.05），而肝胰臟中脂肪酶活性在不同pH 下差異顯著（P＜0.05）；同一pH 條件下，肝胰臟與腸道各部位脂肪酶活性的差異極顯著（P＜0.01），腸道各部位之間無顯著差異（P＞0.05）。在pH7.4 時，肝胰臟與腸道各部位的脂肪酶總酶活差異極顯著（P＜0.01）。蒙古鲌肝胰臟中脂肪酶活性最高，而腸道中較低，后腸脂肪酶活性不到肝胰臟的10%，這說明脂肪酶可能主要由肝胰臟分泌，分泌后即具有較高的活性，不需要進入到腸道后被進一步激活，而腸道僅僅是輔助脂肪的消化，可能在殘余脂肪的消化與吸收中起作用。

圖5 在不同pH 下蒙古鲌肝胰臟和腸中脂肪酶活力Fig.5 The lipase activity in hepatopancreas and intestine exposed to various pH values in culter Culter mongolicus

圖6 pH7.4 時蒙古鲌肝胰臟和腸中脂肪酶活性Fig.6 The lipase activity（IU/g）in hepatopancreas and intestine exposed to pH 7.4 in culter Culter mongolicus

3 討論

3.1 食性與消化酶

魚的食性可分為肉食性、草食性和雜食性，與其消化機能和消化器官組織結構相輔相成[20]。每種消化器官的消化性能不同，消化酶的活性也具有十分明顯的差異。一般肉食性魚類的消化道比較短，蛋白酶活性強；草食性魚類的消化道比較長，淀粉酶的活性強[21]。吳婷婷等[22]研究發現，蛋白酶活性與食性有關，蛋白酶活性大小為肉食性魚＞雜食性魚＞草食性魚。蒙古鲌的腸道及肝胰臟中蛋白酶和淀粉酶的活性均較高，尤以蛋白酶的活性較高，說明蒙古鲌對蛋白質食物的消化利用能力較強，在生產中應注意蛋白質飼料的供應。

由表1 可知：翹嘴紅鲌Erythroculter ilishaeformis腸道中蛋白酶活性差異不大，而肝胰臟與腸道蛋白酶活性差異顯著（P＜0.05）[23]。本實驗中，蒙古鲌前腸蛋白酶活性與中腸、后腸差異顯著（P＜0.05），與肝胰臟差異性不大。本試驗中，蒙古鲌肝胰臟脂肪酶活性明顯比前、中、后腸都要高出許多，而翹嘴紅鲌肝臟中脂肪酶活性與中、后腸無顯著差異（P＞0.05），與前腸差異顯著（P＜0.05）[23]。這兩種魚不同部位的淀粉酶活性差異與脂肪酶相似。上述差異的直接原因是物種不同，也可能與兩種魚采樣時的生長發育階段不同有關，或者因為兩種魚生長環境不同，食物來源與數量也不一樣。周景祥等[24]認為，蛋白酶原主要由肝胰臟分泌，肝胰臟的蛋白酶活性很弱或者可以說沒有活性，而腸道可分泌能激活蛋白酶原的腸激酶，使其具有活性，這可能也是翹嘴紅鲌腸道中的蛋白酶活性明顯高于肝胰臟的原因。

3.2 同一部位不同消化酶活力的比較

本研究結果顯示，pH 對蒙古鲌不同消化部位3 種消化酶的活力均有一定的影響，在設定的pH范圍內，均呈先上升后下降的趨勢，均在pH7.4 時酶活力最高。蒙古鲌各種消化酶的總酶活都是肝胰臟中最高，腸道迅速下降，說明蒙古鲌的肝胰臟是分泌各種消化酶的主要組織。蒙古鲌同一部位不同消化酶活力的變化與黑脊倒刺鲃Spinibarbus caldwelli[11]、黃鱔Monopterus albus[12]、翹嘴紅鲌[14]、草魚Ctenopharyngodon idellus[18]、興凱湖四種鲌[23]、鱖Siniperca chuatsi[20]、寶石鱸Scortum barcoo[25]等研究結果一致，表明蒙古鲌肝胰臟和前腸具有較強的消化酶水解酶活性，是消化、降解消化酶的主要場所。而到了中、后腸，大部分的消化酶都已經被降解為小分子物質，因而活性較低。蒙古鲌消化酶活性可能受水體環境、溫度和食性等諸多因素的影響，還有待進一步研究。

表1 蒙古鲌與翹嘴紅鲌肝胰臟和腸中消化酶活性的比較Tab.1 Comparison of digestive enzyme activity in hepatopancreas and intestine between culter Culter mongolicus and top mouth Erythroculter ilishaeformis

3.3 小結

在30℃和不同pH 條件下，蒙古鲌肝胰臟、前腸、中腸和后腸中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性均呈先上升再下降的趨勢；在不同pH 下肝胰臟中3 種消化酶活性差異性顯著（P＜0.05），腸道各部位中3 種消化酶活性則無差異性（P＞0.05）。在pH7.4時各部位的酶活性最高，蛋白酶比活力強弱順序為：前腸＞肝胰臟＞中腸＞后腸；淀粉酶比活力強弱順序為：肝胰臟＞前腸＞中腸＞后腸；脂肪酶比活力強弱順序為：肝胰臟＞前腸＞中腸＞后腸。說明肝胰臟是蒙古鲌消化酶的主要分泌場所，前腸為其主要消化部位。