亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態性與冠心病患者冠狀動脈病變及葉酸水平相關性研究

李 垚，陳萬林，楊 平，左寶功

(1.陜西省寶雞市人民醫院心血管內一科，陜西 寶雞 721000；2.陜西省千陽縣人民醫院心內科，陜西 寶雞 721100)

冠心病即冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，是患者冠狀血管動脈出現動脈粥樣硬化導致血管變窄、阻塞引起心肌缺氧或缺血性壞死的一種心臟病[1]。出現冠心病的人群以中老年居多，此外高血壓、糖尿病患者或過度肥胖的人群也存在較大的患病風險。冠心病患者病情嚴重時，存在猝死的風險，對患者生命安全存在嚴重威脅。一般冠心病的產生與患者膽固醇過高、季節變化、情緒激動、體力活動增加、飽食、大量吸煙和飲酒等因素有關[2]。隨著臨床基因研究的逐漸深入發現血漿同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)與冠心病產生之間存在著明顯的關系，因此亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因作為Hcy的關鍵代謝酶受到了臨床醫療團隊的廣泛關注[3]。本研究對98例冠心病患者的MTHFR C677T多態性的特點與其冠狀動脈病變情況及葉酸水平之間的關系進行分析，進一步對冠心病患者的發病相關機制進行研究，為臨床預防和治療冠心病患者提供借鑒資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入受檢者為2018年12月至2020年6 月在我院接受檢查或治療的98例冠心病患者和同期的35例正常受檢者，冠心病組中有男性患者54例，女性患者44例，年齡45～62歲，平均(51.44±3.21)歲。經冠狀動脈造影判斷患者冠狀動脈病變情況分布為：冠狀動脈單支病變35例，冠狀動脈雙支病變34例，冠狀動脈三支病變29例。患者冠心病分型情況為：穩定型心絞痛27例，不穩定型心絞痛22例，急性心肌梗死25例，缺血性心肌病24例。正常組有男性19例，女性16例，年齡42～65歲，平均(52..37±4.32)歲。兩組受檢者除疾病信息外的基礎資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。病例納入標準：①冠心病組患者均符合冠心病的診斷標準；②所有受檢者均同意配合本研究相關檢查及標本取樣，并已經簽署知情同意書；③本研究經醫院倫理委員會審核同意并在其監督下執行。排除標準：①冠心病組患者除冠心病外還存在其他可能影響試驗結果的心血管相關疾病；②兩組受檢者存在肝、腎功能障礙或免疫機制障礙；③受檢者患有惡性腫瘤疾病或結締組織慢性疾病；④患者此前服用過可能對葉酸等其他試驗指標產生影響的相關藥物或接受過相關治療。

1.2 研究方法

1.2.1 MTHFR C677T基因多態性檢測：在清晨分別抽取受檢者5 ml空腹靜脈血并將其置于抗凝試管中，使用離心機以3000 r/min的速度離心15 min后棄上清采用鹽析法對下層血細胞進行DNA提取。使用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性獲得MTHFR C677T基因分型。使用PCR擴增儀進行反應，PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min，34個循環擴增(94 ℃ 45 s，61.5 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s)，72 ℃延伸7 min。反應結束后取2%的瓊脂糖凝膠5l進行電泳，對PCR產物擴增情況進行觀察并詳細記錄，在相應位置如果發現清晰的擴增條帶則進行酶切反應。將5l PCR產物并向其中加入5 U限制性內切酶HINFⅠ在37 ℃環境下水浴酶切4 h。將酶切產物使用3%的瓊脂糖凝膠進行電泳并使用電泳成像系統進行觀察并記錄相關數據(圖1)。

1.2.2 血漿Hcy檢測：按照相同方式抽取3 ml空腹靜脈血后將其置于抗凝試管中，在4 ℃環境下以3000 r/min的速度離心5 min后留取上層血漿在-70 ℃存放等待檢測。使用同型半氨酸試劑盒在帶有熒光檢測器的高壓液相層析儀系統中采用速率法進行檢測。

圖1 MTHFR C677T多態性電泳圖

1.3 觀察指標 ①對冠心病患者和正常受檢者的MTHFR C677T基因型及等位基因頻率分布情況進行對比。②對不同病變程度冠心病患者葉酸水平及MTHFR C677T基因型頻率分布情況差異進行對比。③對不同MTHFR C677T基因型中Hcy水平分布情況進行對比。

2 結 果

2.1 兩組受檢者MTHFR C677T基因型、等位基因頻率分布及Hcy水平比較 兩組受檢者MTHFR C677T基因型及等位基因頻率分布比較差異無有統計學意義(P>0.05)，冠心病組患者Hcy水平顯著高于正常組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 不同病變程度冠心病患者葉酸水平及MTHFR C677T基因型分布比較 從受檢患者MTHFR C677T基因型分布情況來看，隨著患者冠狀動脈病變情況的程度加深患者TT及TC基因型頻率分布和患者Hcy水平逐漸增加，CC基因型頻率分布逐漸下降，TC、CC基因型和Hcy水平組間對比差異具有統計學意義(P<0.05)，TT基因型頻率分布組間對比差異不具有統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 兩組受檢者MTHFR C677T基因型、等位基因頻率分布以及Hcy水平的差異

表2 不同病變程度冠心病患者Hcy水平及MTHFR C677T基因型分布比較

2.3 不同MTHFR C677T基因型中Hcy水平分布 從MTHFR C677T基因型與Hcy水平的關系來看，TT、TC基因個體的Hcy水平均較CC基因個體高，組間對比差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同MTHFR C677T基因型Hcy水平分布

3 討 論

冠心病是臨床上較為常見的心血管疾病之一，又被稱之為冠狀動脈粥樣硬化心臟疾病，冠心病主要是指疾病的發生發展以及多個不同因素所致，像常見的血液脂質代謝紊亂，甚至患者的血液中存在部分脂質粘附在人體的血管壁上，進而導致患者發生心肌缺血以及供氧不足等情況，最終致使患者發生心肌壞死[4-5]。冠心病作為心血管疾病的一種是非傳染性疾病中具有較高病死率的疾病，是導致臨床患者病死率上升的主要原因之一[6]。Hcy是人體進行多種生化反應過程中產生的一種非必需氨基酸，它主要是通過激活的甲硫氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸進而水解生成葉酸，當人體內Hcy水平上升也就說明其葉酸濃度變低[7]。葉酸在人體中通過甲基化過程參與到蛋氨酸的循環之中，進入機體的葉酸在二氫葉酸還原酶作用下轉變為二氫葉酸，之后進一步轉化為四氫葉酸；在絲氨酸羥甲基轉移酶的作用下，四氫葉酸活化為5，10-亞甲基四氫葉酸，這個反應過程是具有可逆性的；在亞甲基四氫葉酸還原酶的作用下，5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸；同型半胱氨酸、維生素B12，在蛋氨酸合成酶作用下，5-甲基四氫葉酸為其提供甲基，合成蛋氨酸，而在這個環節中MTHFR是關鍵性的調控酶[8-9]。葉酸在人體多種生活反應中參與并起著重要作用，它能夠促進嘌呤和嘧啶的合成以及參與DNA和RNA與蛋白質的甲基化過程進而對DNA的代謝產生影響。既往在醫學領域公認的冠心病獨立危險因素只有高血壓、高血脂、糖尿病以及吸煙、肥胖等個人因素，但是隨著臨床研究的不斷深入，臨床上有許多研究都指出葉酸水平的變化與冠心病存在密切的相關性[10-11]。這主要是因為Hcy產生的超氧化物和過氧化物可導致血管內皮細胞損傷和低密度脂蛋白氧化，造成血管平滑肌的持續性收縮以及缺氧，從而加速動脈粥樣硬化的過程，因而葉酸水平的檢測已經成為冠心病診斷的重要指標[12]。同時還提示患者存在患有其他與動脈粥樣硬化相關的血管病、腦卒中、類風濕性關節炎、多種癌癥等疾病[13-15]，提示臨床治療中能夠通過指導患病高風險人群飲食或增加攝入B族維生素及葉酸，降低血漿中同型半胱氨酸水平，從而減少心、腦血管病的患病危險性，對于心腦血管患者而言也能通過這種方式緩解癥狀，控制病情進展。

本研究中顯示從數據上看冠心病患者的MTHFR C677T基因型及等位基因頻率分布以及血清Hcy水平均明顯高于正常人群，可見兩者與冠心病患者的發病危險性存在著明顯的關系，同時提示臨床研究中可將其作為冠心病診斷方式之一。既往臨床經驗提示與葉酸濃度變化相關的冠心病患者在臨床上占據絕大部分，也都是導致冠心病患者死亡的重要原因之一，這主要是因為人體內葉酸濃度過低，Hcy在人體中濃度及水平上升進而影響血管內皮細胞，對其造成損傷進而導致動脈血管硬化或形成粥樣斑塊進而引起冠心病等心腦血管疾病的形成。張恩科等[13]對近年來MTHFR基因多態性的研究進行回顧分析發現其與高血脂癥的產生存在明顯的關系，同時指出其與心腦血管疾病產生的相關危險因素關系密切，符合本研究結果。從冠心病患者病變情況與患者MTHFR C677T基因型頻率分布以及血清Hcy水平的情況來看，隨著患者冠狀動脈病變的發展其TT及TC基因型呈現增加的趨勢，患者的血清Hcy水平也明顯增加，而CC基因型分布則呈現較為明顯的下降趨勢。這說明Hcy水平與MTHFR C677T基因型分布情況與冠心病病情發展之間均存在明顯的關系。單獨分析MTHFR C677T基因型與血清Hcy水平的關系可以發現攜帶T型基因的患者個體明顯血清Hcy水平更高，因而可以猜測Hcy水平的上升應該與等位基因T之間存在者明顯的關系。舒放等[14]同樣指出Hcy水平的上升與MTHFR C677T基因T存在明顯關系，但其在研究中還指出男性患者缺乏葉酸者更容易產生高Hcy血癥。本研究中納入的患者男女人數差異較小，未能發現性別與患者患病風險之間的顯著差異性，同時也提示在之后的研究中應該進一步豐富相關資料對患病風險的影響因素深入分析。

綜上所述，MTHFR C677T基因多態性與Hcy水平以及冠心病患者發病風險之間存在明顯的關系，患者血清Hcy水平上升以及MTHFR C677T基因型多態性尤其是攜帶T基因型的患者具有較高的冠心病患病風險，同時MTHFR C677T基因型多態性還與冠心病患者的病情進展存在一定聯系，能夠對冠心病患者的病情進展狀況進行判斷增加了臨床針對性治療和患者療效評價的有效參考指標。但是本研究中仍然存在問題與不足，此次研究納入樣本數量較少，難以體現不同基因型之間的分布差異，后續研究中應當增加研究對象標本數量完善研究結果，提高研究結果的有效性。