自噬在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究

陳運(yùn)轉(zhuǎn) 呂愛紅 王軍杰 辛 凱 趙 曼△

1)鄭州人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000 2)河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

研究報(bào)道缺血性腦血管疾病占腦卒中的80%[1]，嚴(yán)重危害人類健康。大腦缺血后，如果腦組織壞死前閉塞的腦血管再通，會(huì)導(dǎo)致腦神經(jīng)損傷進(jìn)一步加重，即腦缺血再灌注損傷，這是多種腦血管疾病的重要病理生理基礎(chǔ)。腦缺血后不可避免地發(fā)生缺血再灌注損傷，腦缺血再灌注損傷的確切機(jī)制尚未完全闡明，目前研究表明氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡在其中起非常重要的作用[2-5]。自噬(autophagy)指細(xì)胞內(nèi)的溶酶體降解自身損壞的細(xì)胞器和其他無用的大分子過程，對(duì)于維持缺氧、營養(yǎng)缺乏等壓力條件下的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生存具有至關(guān)重要的作用[6-7]。最近的研究顯示自噬可能參與對(duì)腦缺血/再灌注后的神經(jīng)元損傷，其不僅可以通過經(jīng)典的溶酶體途徑清除受損的細(xì)胞器和生物大分子，而且可以通過影響凋亡和壞死的發(fā)生、發(fā)展調(diào)控神經(jīng)元死亡[8]。微血管病變和血栓形成所致的腦神經(jīng)損傷是狼瘡腦病的主要病理基礎(chǔ)，有研究發(fā)現(xiàn)自噬障礙與狼瘡腦病的發(fā)生有關(guān)。然而，目前對(duì)腦缺血再灌注損傷中自噬現(xiàn)象的研究尚不深入。腦缺血再灌注損傷后，自噬如何激活以及自噬參與腦神經(jīng)損傷的作用機(jī)制尚未明確。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在通過研究自噬在腦缺血再灌注中發(fā)揮的作用，以期進(jìn)一步了解自噬在神經(jīng)細(xì)胞損傷中的機(jī)制，為將來通過調(diào)控細(xì)胞自噬治療狼瘡腦病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠(n=108)，鼠齡3～4個(gè)月，體質(zhì)量220～250 g(北京華阜康公司)。

1．2主要試劑3-甲基腺嘌呤(美國Sigma公司)，10%水合氯醛(北京化工三廠)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1．3動(dòng)物分組及模型制作

1．3．1 動(dòng)物分組：選用健康SD大鼠(n=108)，隨機(jī)分為3組各36只：①假手術(shù)組；②對(duì)照組；③3-MA組，然后根據(jù)再灌注時(shí)間(6 h、12 h和24 h)將各組再隨機(jī)分為3個(gè)亞組各12只。假手術(shù)組：手術(shù)分離右側(cè)頸總動(dòng)脈；對(duì)照組：腦缺血再灌注損傷模型建立前30 min，左側(cè)側(cè)腦室注射0.9%氯化鈉注射液0.6 μL；3-MA組：腦缺血再灌注損傷模型建立前30 min，左側(cè)側(cè)腦室注射3-MA溶液0.6 μL(約合600 nmoL)。

1．3．2 建立模型：參照以往實(shí)驗(yàn)方法并改良，建立腦缺血再灌注動(dòng)物動(dòng)物模型：①10%水合氯醛(3.0 mL/kg)腹腔注射麻醉；②麻醉后將大鼠固定在操作臺(tái)上，取仰臥位；③頸部正中縱行切開長約3.0 cm的皮膚，游離皮下組織；④游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，并向頭部游離，自頸總動(dòng)脈分叉處向遠(yuǎn)端分離頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈；⑤動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈；頸總動(dòng)脈末端處剪一小口，向近端牽拉頸總動(dòng)脈殘端結(jié)扎線，將頸總動(dòng)脈末端和頸內(nèi)動(dòng)脈方向一致，將線栓處理端置入，留線適當(dāng)結(jié)扎；⑦取下動(dòng)脈夾，向遠(yuǎn)端插入線栓，插入深度18～20 mm；⑧結(jié)扎頸總動(dòng)脈殘端插線處，固定線栓，將結(jié)扎絲線剪斷；皮膚外保留線栓尾端10 mm，逐層縫合；⑨2 h后，大鼠麻醉狀態(tài)下向近端牽拉線栓使血供恢復(fù)，并剪斷線栓尾端。

1．4模型成功的判定假手術(shù)組大鼠術(shù)后未見神經(jīng)功能缺失，對(duì)照組和3-MA組大鼠經(jīng)過手術(shù)后可見，栓塞對(duì)側(cè)的大鼠肢體出現(xiàn)行走異?；蚧顒?dòng)性功能障礙，嚴(yán)重的出現(xiàn)昏迷，據(jù)此證實(shí)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型制作成功。

1．4．1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：采用Longa 5[9]分法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：提尾懸空后不能伸展左側(cè)前爪；2分：行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走困難，并向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走或昏迷。評(píng)分1～3分大鼠納入研究。

1．4．2 TTC染色：根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，10%水合氯醛以劑量4.0 mL/kg注射于大鼠腹腔，麻醉滿意后處死。取出腦組織，將小腦、腦干低位切除出來，冷凍在-20 ℃冰箱 min，冠狀位，由前向后將腦組織切成5片，快速放入2%TTC溶液中，在37 ℃恒溫干燥箱中避光染色30 min(中間翻轉(zhuǎn)幾次，均勻、充分染色)，最后將腦組織切片用4%多聚甲醛溶液固定，24 h后拍照，正常腦組織與TTC反應(yīng)呈紅色，腦梗死組織呈蒼白色。TTC圖像分析系統(tǒng)測定梗死面積與腦片面積百分比值。

1．4．3 腦組織含水量：根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，10%水合氯醛麻醉后斷頭處死。快速取出腦組織，將嗅球、小腦、腦干分離出來，分離后的腦組織沿中線分為左右半球，將右側(cè)大腦半球放在精密電子天平，稱重為腦組織濕質(zhì)量。后置于電熱恒溫(70 ℃)干燥箱，72 h后恒質(zhì)量(連續(xù)兩次腦組織稱質(zhì)量差<0.001 g)，稱重為腦組織干質(zhì)量。根據(jù)Elliot公式，計(jì)算出各組大鼠腦組織干濕質(zhì)量百分比。Elliot公式：腦組織含水量%=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1．4．4 透射電子顯微鏡：①電鏡標(biāo)本制作：根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，10%水合氯醛麻醉后斷頭處死?？焖偃〕瞿X組織，在冰上將右側(cè)海馬組織分離出來，后將其切割成體積約1 mm3的組織塊，預(yù)冷2.5%戊二醛溶液，將組織塊迅速放入其中，4 ℃冰箱保存，完成預(yù)固定。②電鏡切片制備流程及染色：漂洗→后固定→脫水→浸透→包埋→切片及染色→攝片(透射電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞)。

2 結(jié)果

2．1神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分依據(jù)Longa 5分法，對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評(píng)分。假手術(shù)組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀，對(duì)照組和3-MA組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀，如行走向左側(cè)畫圈、向左側(cè)傾倒、偏癱、追尾現(xiàn)象、前爪抓力下降、后肢向后移位、爬行困難等。對(duì)照組和3-MA組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)Longa評(píng)分與假手術(shù)組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組和3-MA組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)Longa評(píng)分組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2．2TTC染色假手術(shù)組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腦組織未見梗死灶，呈紅色，均勻一致。對(duì)照組和3-MA組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)左側(cè)腦組織呈紅色，均勻一致，未見梗死灶，右側(cè)腦組織見邊界清楚、面積不等的呈蒼白色的梗死灶。對(duì)照組和3-MA組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腦梗死體積百分比與假手術(shù)組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組和3-MA組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腦梗死面積百分比組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表1 各組大鼠Longa評(píng)分結(jié)果 (分，

表2 各組大鼠腦梗死面積百分比結(jié)果

圖1 各組大鼠TTC染色觀察Figure 1 TTC staining observation of rats in each group

2．3腦組織含水量假手術(shù)組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腦組織含水量大致保持恒定，對(duì)照組和3-MA組大鼠腦組織含水量隨著時(shí)間的推移而升高。對(duì)照組和3-MA組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腦組織含水量與假手術(shù)組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組和3-MA組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腦組織含水量組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織含水量結(jié)果

2．4透射電子顯微鏡假手術(shù)組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)海馬神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞器(線粒體、高爾基體)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核膜完整，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布，未見細(xì)胞自噬現(xiàn)象。對(duì)照組大鼠在6 h時(shí)海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)見線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞，部分嵴斷裂，可見少量初級(jí)、次級(jí)溶酶體，可見少量自噬溶酶體，可以觀察到略有固縮凝集的細(xì)胞核染色質(zhì)；在12 h、24 h時(shí)對(duì)照組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)見明顯腫脹的線粒體，且出現(xiàn)空泡樣線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞較前更加嚴(yán)重，嵴斷裂更加明顯，各級(jí)溶酶體數(shù)量較前增多，出現(xiàn)空泡狀自噬溶酶體，同時(shí)可以觀察到大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)的形態(tài)改變，細(xì)胞核染色質(zhì)附著于細(xì)胞核膜下，呈半月狀或結(jié)節(jié)狀團(tuán)塊，細(xì)胞核膜破裂。見圖2。

圖2 各組大鼠透射電子顯微鏡觀察(×12 000)Figure 2 Transmission electron microscope observation of rats in each group (×12 000)

3 討論

腦是機(jī)體最重要的器官之一，其重量雖然僅占人體質(zhì)量的2%～3%，但其所需血流量卻占心輸出量的20%，血供非常豐富，因此腦組織對(duì)血流灌注依賴性非常強(qiáng)。腦缺血再灌注時(shí)腦組織非常依賴的微循環(huán)發(fā)生障礙、細(xì)胞代謝紊亂，一系列病理生理改變相繼發(fā)生，最終導(dǎo)致大腦出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷性改變、功能障礙等[10-11]。實(shí)驗(yàn)研究表明鼠頸動(dòng)脈被阻斷后腦膜內(nèi)微血管收縮顯著，有些微血管周圍能夠見到滲出，通過再灌流，腦膜缺血的情況雖然得到部分改變，但仍然不能達(dá)到阻斷前水平[12]。腦對(duì)缺氧高度敏感，且神經(jīng)細(xì)胞高度依賴葡萄糖酵解提供能量，故長時(shí)間腦缺血?jiǎng)荼貙?dǎo)致缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞水腫、電活動(dòng)停止、功能障礙，細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡被激活，神經(jīng)細(xì)胞甚至極有可能會(huì)發(fā)生不可逆的損傷。

對(duì)于腦缺血再灌注損傷，以往研究的其病理機(jī)制主要集中在線粒體損傷、氧自由基損傷、興奮性氨基酸的細(xì)胞毒性作用、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載以及凋亡基因激活等方面[13]，如腦缺血再灌注損傷后產(chǎn)生的大量自由基，會(huì)破壞線粒體結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致一些酶活性丟失，從而引發(fā)一系列的病理過程。自噬廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，是一種溶酶體依賴的降解過程，屬高度保守的生理機(jī)制，與細(xì)胞分化、存活和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[14-15]。近年來，越來越多的研究表明自噬參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程[16-18]。腦缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)自噬現(xiàn)象的發(fā)生[19-20]。當(dāng)腦組織缺血、缺氧后，組織內(nèi)發(fā)生能量代謝障礙、大量的氧自由基產(chǎn)生堆積、興奮性氨基酸的釋放及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，這些因素都可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

然而自噬在缺血再灌注損傷過程中到底起著保護(hù)還是損傷的作用一直是有爭議的[21-23]。近年來的研究更多顯示，在腦缺血再灌注損失中自噬的激活可以起到保護(hù)神經(jīng)元、減輕缺血性損傷的作用。自噬發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[24]，機(jī)制可能包括以下幾方面：(1)細(xì)胞內(nèi)耗能產(chǎn)物降解，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持，細(xì)胞死亡延遲；(2)受損線粒體降解，細(xì)胞凋亡抑制[25]；(3)神經(jīng)突觸降解，能量提供[26]。PENG等[27]在神經(jīng)元的原代培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，線粒體融合蛋白Mitofusin-2可以通過促進(jìn)自噬的發(fā)生顯著改善腦缺血再灌注損傷。CARLONI等[28]研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠缺血缺氧后可以在短時(shí)間內(nèi)觀察到自噬的激活，當(dāng)用自噬抑制劑三甲基腺嘌呤或渥曼霉素后，新生大鼠損傷加重；相反，當(dāng)應(yīng)用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素后可以使新生大鼠的腦損傷程度減輕。研究顯示，在大鼠局灶性腦缺血再灌注模型中再灌注階段可以觀察到自噬的激活，從而起到對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，不論是用自噬抑制劑3-MA還是敲除自噬相關(guān)基因Atg7基因都會(huì)增加細(xì)胞色素C的釋放和細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而對(duì)加重神經(jīng)元的損害[25]。CAI等[29]研究也發(fā)現(xiàn)，甘氨酸對(duì)缺氧缺血性腦損傷保護(hù)作用，可能是通過AMPK途徑調(diào)節(jié)線粒體自噬進(jìn)而實(shí)現(xiàn)的。上述研究均表明自噬在腦缺血再灌注過程中是具有保護(hù)作用的。

本研究中假手術(shù)組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)腦組織未見梗死灶，對(duì)照組和3-MA組大鼠左側(cè)腦組織未見梗死灶，右側(cè)腦組織見邊界清楚、面積不等呈蒼白色的梗死灶。對(duì)照組和3-MA組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)梗死灶面積占比比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE染色見假手術(shù)組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，呈層狀分布；3-MA組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度消失，海馬神經(jīng)細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)大部分破壞；較3-MA組，對(duì)照組大鼠相應(yīng)時(shí)點(diǎn)海馬神經(jīng)細(xì)胞雖然也消失，但大部分海馬神經(jīng)細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)尚存在。本研究可見腦缺血再灌注可致神經(jīng)細(xì)胞損傷，細(xì)胞出現(xiàn)自噬現(xiàn)象，表現(xiàn)為大鼠神經(jīng)功能缺失，缺血側(cè)腦組織見梗死灶，梗死灶內(nèi)海馬神經(jīng)細(xì)胞受損。

本研究表明，腦缺血再灌注損傷中3-MA作為自噬的抑制劑可致神經(jīng)元損傷加重，自噬的激活可能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。缺血再灌注可致神經(jīng)細(xì)胞損傷，細(xì)胞出現(xiàn)自噬現(xiàn)象，表現(xiàn)為大鼠神經(jīng)功能缺失，缺血側(cè)腦組織見梗死灶，梗死灶內(nèi)海馬神經(jīng)細(xì)胞受損，細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體顯著增多；在腦缺血再灌注損傷中抑制細(xì)胞自噬可致神經(jīng)元損傷加重，自噬的激活可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。