等離子處理對碳微球在MALDI-TOF-MS基質效應研究

趙亞男， 孟龍月，b， 金 彪，c

（延邊大學a.理學院化學系；b.地理與海洋科學院；c.分析測試中心，吉林延吉133002）

0 引 言

近年來，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）由于其軟電離、高通量、質量檢測范圍寬、準確度高、靈敏度高、耐鹽度高、樣品需求量少、分析速度快等優點被廣泛應用于蛋白質、多肽、多糖、寡核苷酸及氨基酸等生物分子檢測領域［1］。在MALDI-TOF-MS檢測過程中，基質起著舉足輕重的作用，不僅可以提高待測分子的分散度，并且能吸收激光能量，轉化為待測分子的激發能，從而使待測分子在MALDI-TOF-MS中被電離及檢測。常見基質主要分為有機基質［2］與無機基質，其中，金屬材料、沸石材料及半導體材料［3-4］等無機基質由于離子化效率高、結晶均勻等優點被廣泛應用于生物分子物質的檢測。然而，金屬材料價格昂貴，且制備過程復雜，半導體材料實用性差，沸石材料性能不穩定等缺點使得MALDITOF-MS檢測生物分子存在一定的局限性。

近年來，碳材料因其優良的電子轉移能力和較強的激光能量吸收能力，良好的化學穩定性，不易與生物分子發生反應等特性在MALDI-TOF-MS 檢測生物分子領域備受關注［5-7］。碳微球作為一種小尺寸碳材料，由于其低成本、良好的導電性及小尺寸效應等優點使得作為基質在檢測生物分子領域得到進一步拓展［8］。然而，碳微球表面官能團類型雜亂，粒徑大小不均勻，致使其在溶劑中分散性較差、結晶困難［9］。為了提升碳微球性能，科研工作者們通常采用元素摻雜、活化處理和等離子處理等方式對碳微球形貌、粒徑和表面官能團進行優化［10］。其中，碳材料經過等離子處理后，材料粒徑尺寸更加均勻，氧元素含量及表面粗糙度顯著增加，在催化、電容器、電池等領域具有顯著的影響［11-12］。本文通過對碳微球進行等離子改性，碳微球表面—COOH、—OH 及—C ＝O 等含氧官能團不僅增大碳微球在溶劑中的分散性，同時也增強碳微球與亮氨酸的結晶能力，可有效保護樣品分子不受損壞，從而提高作為MALDI-TOF-MS 基質檢測生物分子的能力。本文將聚吡咯基碳微球（PPy-CMSs）與碳黑基碳微球（CB-CMSs）作為MALDI-TOF-MS 基質對亮氨酸進行檢測，考察在不同等離子處理時間、溶劑及濃度下，碳微球作為基質效果的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（AXIMACFRTMplus 島津公司）；K1050X 等離子灰化儀（Emitech Ltd）；真空／氣氛管式電爐（天津市中環實驗電爐有限公司）；5700 型紅外光譜儀（美國尼高力）；掃描電子顯微鏡（SEM SU8000，日本日立高新技術公司）；乙腈（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；乙醇（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；甲醇（分析純，北京化工廠）；去離子水（Millipore 純水系統）；亮氨酸（分析純，上海康達氨基酸廠）；六水三氯化鐵（分析純，天津市光夏科技發展有限公司）；吡咯，碳黑均購自Sigma。

1.2 碳微球的制備

配置0.5 mol／L六水三氯化鐵水溶液400 mL，將6.2 mL吡咯單體（Py）滴加進溶液，攪拌2 h使其完全反應。經過抽濾、去離子水洗滌至中性，烘干12 h 后研磨成粉末備用，命名為PPy-1，將PPy-1 采用真空／氣氛管式電爐中（程序升溫為5 ℃·min－1）碳化制備PPy-CMSs。

1.3 等離子處理碳微球

K1050X等離子灰化儀：腔室壓力0.1 kPa，真空度1 mPa，工作功率70 W，13.56 MHz，氮氣（N2）為保護氣，氬（Ar）氣流量為20 cm3／min 狀態下，分別將PPy-CMSs、CB-CMSs進行不同時間等離子處理（0，1，3，5，7，10 min），樣品分別編號為PPy-CMSs-0，PPy-CMSs-1，PPy-CMSs-3，PPy-CMSs-5，PPy-CMSs-7，PPy-CMSs-10；CB-CMSs-0，CB-CMSs-1，CB-CMSs-3，CBCMSs-5，CB-CMSs-7，CB-CMSs-10。

1.4 分析條件

MALDI-TOF-MS：采用AXIMA-CFRTMplus N2激光源，發射波長為337 nm。負離子反射模式，加速電壓20 kV，掃描范圍為m／z 100 ～2 000，每張質譜圖由總激光發射脈沖次數為50 的質譜圖平均累計產生。數據采集前，用馬心肌肌紅蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作為標準物，校正儀器的絕對準確度至0.1 Da。將碳微球溶液超聲20 min，亮基酸溶液與碳微球溶液按照體積比V亮氨酸∶V基質＝1∶2，以基質覆蓋待測物方式在靶板點樣，自然干燥，通過MALDI-TOF-MS 負離子模式進行檢測。

2 結果與討論

2.1 SEM分析

碳微球SEM分析見圖1。由圖可看出，碳微球未經等離子處理前粒子形貌分布不規則，形狀無規律，且團聚程度高（圖1（a），（c））。碳微球經過等離子改性后，顆粒外形呈規則球狀，分散性明顯增加（圖1（b），（d））。等離子處理后，兩種碳微球（0.1 mg／mL）均勻分散在溶劑中，呈墨汁狀，無分層現象，溶劑中分散性明顯提高，增大了基質與檢測樣品的共結晶性能。

圖1 碳微球掃描電鏡圖

2.2 紅外光譜分析

碳微球紅外光譜分析見圖2，由圖可以看出，碳微球存在—OH彎曲伸縮振動峰（PPy-CMSs 與CB-CMSs紅外吸收峰分別為3 445、3 441 cm－1），—C ＝O 羰基伸縮振動峰（PPy-CMSs 與CB-CMSs 紅外吸收峰分別為1 645、1 639 cm－1），—C ＝O羧基伸縮振動峰（PPy-CMSs與CB-CMSs 紅外吸收峰分別為1 715、1 719 cm－1）。結果表明，碳微球表面含有羥基、羧基、羰基等含氧官能團，含氧官能團的存在可以顯著提高碳微球在溶劑中的分散性，增大了與氨基酸的共結晶能力。

圖2 PPy-CMSs-5和CB-CMSs-3紅外吸收光譜圖

2.3 碳微球作為MALDI-TOF-MS基質條件

2.3.1 碳微球空白對照實驗

PPy-CMSs-5、CB-CMSs-3 基質背景檢測結果見圖3 中a、k。由圖可以看出，在m／z 100 ～600 Da 區沒有出現大量基質相關裂解峰和雜質峰，大大減少了基質對該區域分析物的干擾，符合小分子質譜檢測要求。

圖3 在不同等離子處理時間和不同溶劑中，PPy-CMSs與CBCMSs基質對亮氨酸的檢測

2.3.2 等離子處理時間對亮氨酸檢測的影響

基質與亮氨酸濃度均為0.1 mg／mL，去離子水為溶劑，PPy-CMSs 經過不同等離子時間改性作為MALDI-TOF-MS基質對亮氨酸檢測，結果見圖3 中b～f。圖中離子信號離子峰顯示，當等離子處理時間為1、3、5、7 和10 min時，［Leu-H］－特征峰強度隨著等離子處理時間變化呈正態分布，處理5 min 時，［Leu-H］－特征峰強度最大，且背景峰最少。CB-CMSs 經過不同等離子時間改性作為MALDI-TOF-MS 基質對亮氨酸檢測，結果見圖3 中l ～p，當CB-CMSs 經等離子處理3 min 時，［Leu-H］－特征峰強度大，且背景峰最少。

綜上所述，等離子改性時間不同造成碳微球表面官能團含量差異，造成碳微球分散性及與亮氨酸結晶解吸效果改變，極大影響碳微球作為MALDI-TOF-MS基質對亮氨酸檢測能力［13-14］。因此，本實驗最佳等離子改性時間為5 min（PPy-CMSs）和3 min（CB-CMSs）。

2.3.3 不同溶劑對亮氨酸檢測的影響

基質與亮氨酸濃度均為0.1 mg／mL，當PPy-CMSs等離子改性時間為5 min，PPy-CMSs在不同溶劑（水、乙醇、甲醇、乙腈）中對亮氨酸檢測結果見圖3 中g ～j。乙醇作為PPy-CMSs溶劑時，［Leu-H］－特征峰強度最大，明顯高于其他3 種溶劑時的特征峰強度。當CB-CMSs等離子改性時間為3 min，CB-CMSs 在不同溶劑（水、乙醇、甲醇、乙腈）中對亮氨酸檢測結果見圖3 中q ～t。去離子水為CB-CMSs溶劑時，［Leu-H］－特征峰強度明顯高于乙醇、乙腈及甲醇作為溶劑時的特征峰，且背景干擾最小。

結果表明，碳微球由于表面—COOH、—OH 等官能團的影響，在不同極性溶劑中分散性不同，與氨基酸共結晶能力差異較大［15］。綜上所述，實驗確定最佳溶劑為乙醇（PPy-CMSs）和去離子水（CB-CMSs）。

2.3.4 不同基質濃度及亮氨酸濃度對檢測的影響

去離子水為溶劑，亮氨酸濃度為0.1 mg／mL，等離子改性時間為5 min（PPy-CMSs）和3 min（CB-CMSs），不同碳微球濃度對亮氨酸檢測結果見圖4 中a ～i（PPy-CMSs）和m ～u（CB-CMSs）。當碳微球濃度為0.02 ～0.10 mg／mL時，如圖4 中a ～e（PPy-CMSs）和m ～q（CB-CMSs）所示，［Leu-H］－特征峰強度隨碳微球濃度的增大而增大。當碳微球濃度為0.20 ～0.50 mg／mL 時，如圖4 中f ～i（PPy-CMSs）和r ～u（CBCMSs）所示，基質背景離子峰明顯增多，未知來源的碎片）峰以及基質加合分子離子峰嚴重影響亮氨酸特征峰強度，無法對質譜進行準確解析。

圖4 PPy-CMSs與CB-CMSs對亮氨酸檢測

碳微球對不同濃度亮氨酸（10，0.1，0.01 mg／mL）檢測結果見圖4 中j ～l（PPy-CMSs）和v ～x（CBCMSs）。圖中離子信號離子峰顯示，兩種基質均順利檢測出［Leu-H］－特征峰。初步確定了亮氨酸的檢測限度為0.76 nmol／mL。

結果表明，碳微球濃度過低導致檢測信號偏弱；濃度過大，溶劑分散性降低，發生團聚現象［16-17］。綜上所述，PPy-CMSs、CB-CMSs最佳濃度為0.1 mg／mL。

3 結 語

通過等離子表面處理法改變了PPy-CMSs 及CBCMSs的表面化學結構，兩種碳微球作為飛行質譜的新基質成功對亮氨酸進行檢測與分析。該檢測方法簡便，材料廉價易得，實驗過程污染小，可控性及重現性良好。該研究拓寬了MALDI-TOF-MS 檢測中基質種類范圍，有望推廣到其他生物小分子檢測之中。