枸杞多糖對重鉻酸鉀所致孕鼠生殖毒性的干預作用研究

李 杜，劉燕群，2△，楊 曄，甘維康，魯雄兵，吳 倩，林可欣，管慶美

(1.江漢大學醫學院，湖北 武漢 430056；2.江漢大學持久性有毒污染物環境與健康危害湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430056)

鉻廣泛存在于人類生存環境中，2017年10月27日WHO國際癌癥研究機構公布的致癌物清單表明，金屬鉻(Cr)離子在3類致癌物清單中。除金屬Cr外，最常見的價態是Cr6+和Cr3+。Cr6+可通過皮膚、消化道、呼吸道等方式進入人體，損害機體，且重鉻酸鉀(PD)對胚胎的生殖毒性已被相關研究證實[1]。

枸杞多糖(LBP)是枸杞子的主要成分之一，是我國傳統中藥素材，具有增強免疫力、抗癌、防衰老、降血壓、降血糖、抑制腫瘤生長和細胞突變等作用[2]。有學者發現，LBP的抗氧化作用可能是其保護雄性生殖功能的機制之一[3]。也有研究表明，LBP具有一定的雄性生殖毒性的拮抗作用[4]。關于PD損害機制的研究較多，但對其損傷機制修復的研究較少[5]，而利用生活中常見的LBP來干預PD所致的孕鼠生殖毒性的研究鮮見報道。鑒于此，本研究選取雌性和雄性SD大鼠自然受孕，通過灌胃PD溶液制造孕鼠PD中毒模型，給予不同劑量LBP溶液干預PD染毒模型大鼠，運用微波消解-電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)法測定各組大鼠胎盤及血清Cr水平，初步探討了LBP對PD致孕鼠生殖毒性的干預作用，本研究已通過本院倫理委員會批準。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 2018年7月選取SPF級SD雌鼠20只和SD雄鼠10只(購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：43004700047638)。大鼠毛發濃密有光澤，身體狀況良好。將大鼠雌雄分開并置于室內(24±1)℃適應性喂養3 d后，將雌鼠隨機分為10組待實驗使用，每組2只，每組雌鼠平均體重為(255±25)g。

1.1.2主要實驗儀器與試劑 LBP購于上海源葉生物科技有限公司，純度大于90.0%；PD購于山東西亞化學股份有限公司，純度99.8%；優級純硝酸購于開封東大化工有限公司。JA2003B電子天平購于上海越平科學儀器有限公司；XD-202倒置生物顯微鏡購于南京江南永新光學有限公司；MD6C型微波消解儀購于北京盈安美誠科學儀器有限公司；iCAP Q型ICP-MS儀購于賽默飛世爾科技公司；離心機購于上海越平科學儀器有限公司等。

1.2方法

1.2.1動物模型創建與分組

1.2.1.1預實驗 確定正式實驗所用的重鉻酸鉀染毒劑量，將8只雌性大鼠分為對照組、低劑量PD(Cr6+)染毒組、中劑量PD染毒組和高劑量PD染毒組。低、中、高劑量PD溶液分別定為1/8半數致死量(LD50)、1/4 LD50、1/2 LD50。將大鼠按上述分組雌雄2∶1配種，每組雌鼠2只與雄鼠1只，正常喂食、喂水，并于每天早上對每只雌鼠做陰道涂片，與顯微鏡下觀察到精子的雌鼠記為懷孕第0天。將這些雌鼠進行標記，PD染毒組于懷孕第3天開始灌胃根據分組所定不同劑量的PD溶液，對照組于懷孕第3天灌胃生理鹽水。對照組及PD染毒組于PD染毒后6 h再次灌胃，均為100 mg/kg LBP溶液。參照文獻[6]確定最佳染毒的灌胃時間，預實驗擬連續灌胃7 d。

1.2.1.2正式實驗 根據預實驗結果，1/4 LD50的PD溶液對SD大鼠染毒效果較好，且大鼠存活率較高，故正式實驗將PD染毒劑量定為1/4 LD50。將雌雄大鼠2∶1分為對照組(灌胃生理鹽水)、PD染毒組、PD染毒給予低劑量(10 mg/kg)LBP組(PD+L-LBP組)、PD染毒給予中劑量(50 mg/kg)LBP組(PD+M-LBP組)、PD染毒給予高劑量(100 mg/kg)LBP組(PD+H-LBP組)和PD染毒給予更高劑量(200 mg/kg)LBP組(PD+MH-LBP組)。每組雌鼠2只與雄鼠1只。采用預實驗的方法測定雌鼠懷孕第0天，于懷孕第3天開始灌胃，對照組灌胃生理鹽水，PD染毒組、PD+L-LBP組、PD+M-LBP組、PD+H-LBP組、PD+MH-LBP組均灌胃1/4 LD50PD溶液。灌胃操作6 h后進行第2次灌胃操作，對照組、PD染毒組灌胃生理鹽水，PD+L-LBP組灌胃10 mg/kg LBP溶液、PD+M-LBP組灌胃50 mg/kg LBP溶液、PD+H-LBP組灌胃100 mg/kg LBP溶液、PD+MH-LBP組灌胃200 mg/kg LBP溶液。根據預實驗結果正式實驗連續灌胃7 d。

1.2.2標本采集 各組雌鼠懷孕后每天稱體重1次，觀察其外觀及生活狀態。懷孕第19天使用水合氯醛麻醉孕鼠后于腹主動脈取血，裝在未加凝血劑的采血管中靜置20 min，隨后3 000 r/min離心10 min。取血后按剖檢順序取下孕鼠肝、腎、胎盤等，用生理鹽水稍加漂洗后吸干臟器表面水分，立即在感量為0.01 g電子天平上稱重，臟器系數=臟器重量/體重。每只孕鼠取3份血清保存待測，每只孕鼠取10個胎盤保存待測。

1.2.3樣品前處理 硝酸是ICP-MS分析中最好的酸介質，因硝酸中含有的氧、氮、氫3種元素，在等離子體所夾帶的氣體中均含有，不會再引入新的多原子離子干擾[7]。配置1%稀硝酸作為標準液。取0.1 mL血清加入1%稀硝酸4.9 mL定容成5 mL溶液。胎盤樣品取每個與微波消解罐中加入10.0 mL優級純硝酸以設定程序：90 ℃運行6 min、120 ℃運行9 min、140 ℃運行15 min進行消解。消解后于電熱板中將多余硝酸趕至1.0 mL裝于容量瓶中使用超純水定容至50 mL。

1.2.4樣品測定 點燃等離子體后儀器預熱30 min至穩定，引入多元素混合調諧溶液調節ICP-MS各項參數，選擇低、中、高質量數元素對ICP-MS靈敏度進行調諧，同時調節氧化物及雙電荷等指標至滿足測定要求，通過三通在線引入內標溶液，依次測定標準溶液、空白溶液和樣品溶液[8]。

2 結 果

2.1各組孕鼠胚胎數比較 PD染毒組孕鼠胚胎數[(11±2)個]均明顯少于對照組、PD+L-LBP組、PD+M-LBP組、PD+H-LBP組、PD+MH-LBP組[分別為(18±1)、(16±3)、(19±1)、(20±1)、(20±1)個]。

2.2各組孕鼠血清及胎盤Cr水平比較 PD染毒組孕鼠血清及胎盤Cr水平均明顯高于對照組、PD+L-LBP組、PD+M-LBP組、PD+H-LBP組和PD+MH-LBP組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 各組孕鼠血清Cr水平比較

表2 各組孕鼠胎盤Cr水平比較

3 討 論

本研究探討了LBP對PD生殖毒性的干預作用，結果顯示，LBP對PD的生殖毒性具有一定的保護作用。本研究對孕鼠連續7 d的灌胃，使其胎盤產生不同梯度的Cr。結果顯示，PD染毒組孕鼠胚胎數明顯少于LBP干預的孕鼠及對照組，說明LBP可阻止PD引起的胚胎數減少。

胎盤Cr水平的增加表明Cr6+可透過胎盤屏障，其強氧化性可對胚胎發育造成影響[9]。本研究參照文獻[10]采用微波消解-ICP-MS法測定了孕鼠血清及胎盤Cr水平，此方法具有操作簡便、基體干擾小、準確度高、精密度高等優點[11]。本研究結果顯示，PD染毒組孕鼠胎盤Cr水平均明顯高于對照組、PD+L-LBP組、PD+M-LBP組、PD+H-LBP組和PD+MH-LBP組，差異均有統計學意義(P<0.05)。給予LBP劑量越大的孕鼠胎盤Cr水平越趨近于對照組，說明LBP能改善Cr6+造成的胎盤損傷，表明LBP對PD所致的生殖毒性具有干預作用。

孕鼠血清Cr水平也有類似胎盤Cr水平的變化規律，給予LBP劑量越大的孕鼠血清Cr水平越趨近于對照組，與胎盤Cr水平呈劑量依賴性關系。胎盤正常功能和形態的建立對胚胎發育十分重要，與胎盤血流量和面積也息息相關，所以，與血清Cr水平變化也十分緊密，進一步說明了Cr可透過胎盤屏障作用于胎盤及LBP的強氧化性對PD的毒性具有干預作用。

HSIEH等[12]研究表明，Cr6+也可損傷卵黃囊，因Cr6+可穿過細胞膜，且具有強氧化性[13]，通過對卵黃囊上皮、間質和間皮層的損害導致卵黃囊功能紊亂。在胎盤循環建立前卵黃囊是胚胎與母體之間進行交換的基本源泉，具有提供營養、參與內分泌等功能，致畸物質常通過母體間接對胚胎發揮致畸作用，而卵黃囊在母體與胚胎間物質運輸中具有關鍵防御作用[14]。LBP對PD所致的生殖毒性保護作用也可影響卵黃囊，與其強大的抗氧化能力有關[15]。但具體的保護機制和最適宜干預劑量尚需進一步研究和驗證。