基于網絡藥理學分析山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的作用機制

楊卜瑞 賀小芳 師晶晶 張鈴枝 陳曉靜 李廷荃 楊麗芳

摘要 目的：基于網絡藥理學探討山戀菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的作用機制。方法：采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）收集山慈菇、浙貝母的活性成分和靶點，并通過Uniprot數據庫選擇對應的藥物作用蛋白質名稱對應基因名，通過Cytoscape3.7.2構建“藥物-活性成分-靶點”網絡圖，同時檢索疾病數據庫（GeneCards）和在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）獲得乳腺癌相關靶點。使用Cytoscape3.7.2構建“活性成分與乳腺癌交集靶點”蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，并對PPI網絡節點進行篩選，得出關鍵靶點;運用Metascape數據庫對關鍵靶點進行基因本體（GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結果：研究從山慈菇-浙貝母藥對中篩選獲得10個重要活性成分，包括β-谷固醇，豆甾醇，2-甲氧基-9，10-二氫菲4，5-二醇，哲貝瑞醇等，作用于FUS和RPL24等71個關鍵靶點。C0富集分析共鑒定出31個條目，包括細胞組分3項、分子功能8項、生物學過程20項。此外，KEGG富集通路分析共確定了14條富集通路。結論：山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的作用體現了中藥多成分、多靶點、多通路的特點，其作用機制可能是通過調控癌癥途徑、調控信號通路途徑、調控介導細胞成熟和改變細胞周期等多個方面發揮治療乳腺癌的作用。本研究為后續進一步研究提供思路和借鑒。

關鍵詞 網絡藥理學;山慈菇;浙貝母;藥對;乳腺癌;腫瘤;作用機制;靶點

中圖分類號：R273;R285

文獻標識碼：A

doi：10.3969/[J].is.1673-7202.2021.21.007

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈現逐年上升趨勢。有研究表明，我國乳腺癌患者5年生存率為83.2%山，在我國，乳腺癌在城市中的發病率為女性惡性腫瘤的第2位，在一些大城市中已上升至第1位，已經成為婦女健康的最大威脅。目前，乳腺癌的治療以手術、放療、化療以及內科綜合治療為主。但手術和放療、化療后脈絡損傷、氣機受阻、氣滯血瘀、瘀血內停、津液出入受阻，易發生皮下積液、皮瓣壞死、上肢水腫、肝腎損傷，影響機體代謝2，因此，中醫藥以其不良反應小、療效好的特點為乳腺癌患者多種并發癥的治療帶來了新的思路。山慈菇，為蘭科杜鵑蘭屬植物杜鵑蘭或獨蒜蘭屬植物獨蒜蘭的假鱗莖。味甘、辛，性涼，歸肝、脾經，具有清熱解毒，消腫散結之功效。現代藥理研究表明：B-谷固醇，豆甾醇，2-甲氧基9，10-二氫菲4，5-二醇是其主要活性成分。浙貝母為百合科植物浙貝母的鱗莖，味苦，性寒，歸肺、心經，有清熱化痰、散結消癰的功效。其主要活性成分為生物堿、多糖和總皂苷等，具有抗潰瘍、鎮痛、鎮咳祛痰、改善肺功能、抗炎、抗氧化、抑制細胞增殖、逆轉耐藥等功效4。其中胡凱文等的發現貝母素甲及貝母素乙對人乳腺癌細胞株MCF-7/ADR可逆轉耐藥5倍以上有效改善乳腺癌的耐藥。同時，臨床療效及藥理研究均表明，山慈菇、浙貝母二者配伍，相須為用，在乳腺癌等實體腫物的治療中可增強軟堅散結的作用，改善乳腺癌局部紅腫熱痛癥狀，抑制瘤體生長。盡管山慈菇-浙貝母是乳腺癌臨床中醫治療的常用藥對，然而其具體作用基因靶點尚不明確，這在一定程度上限制了山慈菇浙貝母藥對在臨床的推廣使用。網絡藥理學作為一門新興學科，旨在通過藥物基因-疾病相互作用分析關系，將傳統中藥與現代藥理學、分子生物學、生物信息學相整合，并為中醫藥藥對在抗擊乳腺癌的過程中提供分子藥理學證據，為乳腺癌的現代中醫診療提供新思路。本課題通過采用網絡藥理學方法從基因水平分析山慈菇-浙貝母的有效成分，預測其作用靶點及相關信號通路，闡釋山慈菇-浙貝母藥對在抗擊乳腺癌過程中的作用機制，為臨床乳腺癌的治療提供依據。

1材料與方法

1.1山慈菇-浙貝母有效成分的收集和篩選在計

算機生物實驗室中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatebaseAnalysisPlatform，TCMSP，https：//tcmspwcom/tcms.php）中藥數據庫，分別檢索山慈菇和浙貝母的所有化學成分，其中山慈菇18個、浙貝母17個。為更好地篩選山慈菇浙貝母藥對中的有效化合物，本研究結合口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18作為活性成分的篩選條件。

1.2藥物靶點基因的篩選在TTCMSP中根據篩選

出的藥對活性分子選擇對應的蛋白靶點，刪除無靶點信息的活性成分。通過Uniprot（htts：//sparql.uniprot.org/）蛋白質數據庫將收集的藥物作用靶點轉化為基因名稱，物種來源為“Homo sapiens”，同時刪除無效靶點，將藥物基因名稱標準化處理后錄入Excel表格。

1.3乳腺癌靶點基因的篩選利用在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org/）iiGenecards（https：//www.genecards.org/）疾病數據庫檢索關鍵詞breastcancer，獲取乳腺癌相關的基因靶點，同時合并2個疾病數據庫的搜索結果，去除重復和假陽性的基因，選擇score》15作為疾病靶點篩選的標準。

1.4構建中藥活性成分-靶點網絡使用Cyto-scape3.7.2軟件構建山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的“中藥-活性成分-靶點”網絡，網絡圖中的節點分別為藥物名稱、化學成分、澘在靶點。其中化學成分與潛在靶點之間有相互作用關系的以邊相連，使用NetworkAnalysis插件對相應網絡進行拓分析。

1.5蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建與分析使用Cytoscape3.7.2的Biso Genet插件分別構建“藥物靶點蛋白質-蛋白質相互作用（Protein Protein InteractionPPI）網絡”和“乳腺癌靶點PPI網絡”。通過”Merge"'功能對2個PPI網絡取交集，獲得交集網絡。使用“analyze network”'功能對網絡拓撲參數進行分析，分析內容包括Degree、Betweenness

Centrality，Closeness Centralityfll Neighborhood Ceon-nectivity。通過Degree、BC、CC和NC指標篩選關鍵靶點，并從關鍵靶點中篩選出活性成分和乳腺癌直接相關的靶點作為核心靶點。

1.6基因本體分析和京都基因與基因組百科全書富集分析利用Metascape數據庫對上述得到的核心靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以了解“山慈菇-浙貝母”藥對的主要成分對于乳腺癌的GO功能和藥對主要成分的靶標蛋白在信號通路中的作用，然后把數據信息錄人微生信平臺進行可視化處理。

2結果

2.1山慈菇-浙貝母有效成分的收集和篩選共收集到山慈菇化學成分18個，浙貝母化學成分17個。篩選山慈菇有效成分3個，浙貝母有效成分7個，山慈菇和浙貝母共有活性成分1個：β-谷固醇。見表1。

2.2藥物靶點的篩選收集刪除無對應靶點信息活性成分Ziebeimine和Chaksine和重復活性成分beta-sitosterol。共得到7個活性成分及對應的131個作用靶點，標準化后共獲取71個對應靶點。

2.3中藥-活性成分-靶點網絡繪制的“藥物活性成分-靶點”網絡圖中共包括76個節點，127條邊。網絡中黃色節點代表藥物，粉色節點代表活性成分，紅色節點代表靶點。網絡拓撲分析提示：4種活性成分能與10個以上的靶點連接，β-谷固醇（Degree=37）、豆甾醇（Degree=28）和2-甲氧基9，10-二氫菲4，5-二醇（Degree=27）3種活性成分能與20個以上靶點連接，Pelargonidin（Degree=15）1種活性成分能與10個以上靶點連接，因此可認為上述4個活性成分是“山慈菇-浙貝母”藥對的主要活性成分。見圖1。

2.4成分靶點PPI網絡構建共獲得與藥物化學成分直接或間接相關的作用靶點3187個，相互關系77135條;對乳腺癌作用的1766個靶點構建PI網絡，獲得與乳腺癌相關活性成分直接或間接作用靶點12249個，相互關系237624條。將2個PPI網絡通過Intersection求交集，得到1個有3124個靶點，76656條相互關系的網絡。篩選交集網絡的關鍵靶點。在交集網絡中，Degree的中位數為28。見圖2。

篩選出Degree》=58的子網絡包含862個靶點和36680個靶點與靶點的相互關系。由于靶點數量較多，故對子網絡進行二次篩選。子網絡的Degree BC、CC、NC的中位數分別為93、6.656×100.405、138.224，選擇Degree≥93、BC=6.656×10-3、CC=0.405、NC=138.224的靶點作為關鍵靶點，最終得到關鍵靶點168個，靶點間相互關系2762條。168個關鍵靶點中前10個與活性成分和乳腺癌均直接相關的靶點分別為：FUS（Degree=72）、RPL24（Degree=69）、RPS2（Degree=67）、EIF4A3（Degree=65）、RPL6（Degree=65）、CUL4B（Degree=64）、TUBGI（Degree_=64）、RPL7反應、凋亡信號通路、生殖結構發育及髓系細胞分化的正調控等多個生物過程。對14條KEGG信號通路進行分析，發現山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的信號通路主要集中為3類，1）調控癌癥途徑hsa05200信號通路、k005210信號通路、hsa0522等多條信號通路通過誘導凋亡發揮抗癌作用。2）信號通路途徑：hsa04915KEGG通路、k04657KEGG通路等多條信號通路與乳腺癌治療密切相關。其中雌激素受體陽性是導致乳腺癌死亡的主要因素hsa04915信號通路通過參與雌激素信號調節發揮治療乳腺癌的作用。ko04657信號通路參與L-17的表達，乳腺癌糖酵解活性的增強與促腫瘤免疫有關，而腫瘤糖酵解與免疫/炎癥功能之間的相互作用可以通過-17信號轉導途徑介導。3）介導細胞成熟和改變細胞周期：hsa04914、ko04972、ko04110等多條通路通過孕酮介導的卵母細胞成熟、影響胰腺分泌以及調控細胞周期共同發揮抗癌作用。

本研究運用網絡藥理學的方法，對山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的作用機制進行研究，研究表明，山慈菇-浙貝母藥對主要通過β-谷固醇、豆甾醇、2甲氧基9，10-二氫菲4，5-二醇、pelargonidin、嘧啶、哲貝瑞醇、6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1，4-禁醌8-0-βD-吡喃葡萄糖苷等活性成分，調節FUS、RPL24等相關靶點的表達，進而干預hsa05200、hsa05161koO5210、hsa04915、ko04933、ko04657、hsa05222hsa04919、ko05164、hsa05215、ko04370、hsa04914ko04972、ko0410等多條乳腺癌相關通路，從調控癌癥途徑、調控信號通路途徑、調控介導細胞成熟和改變細胞周期等多個方面發揮治療乳腺癌的作用。山慈菇-浙貝母藥對治療乳腺癌的作用機制體現了山慈菇-浙貝母藥對多靶點、多通路協同作用的特點。本研究可為中藥藥對參與乳腺癌治療提供思路和借鑒，也為臨床應用提供一定的依據。

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（2020-11-30收稿責任編輯：王明

基金項目：國家自然科學基金面上項目（8187474）——鹿茸通過P3KAKT信號通路調控EPCs動員及歸巢促進PAD大鼠血管新生的作用機制;山西省重點研發計劃項目（201803D31203）蟾蜈止痛膏治療中重度癌性疼痛的臨床研究;蕭氏脾胃學術流派傳承工作室建設項目（2020PY-LP-08）

作者簡介：楊卜ト瑞（1993.12-），男，碩士研究生在讀，研究方向：中醫腫瘤，E-mai：870112459@qq.com

通信作者：楊麗芳（1967.05-），女，碩士，主任醫師，研究方向：中醫腫瘤，E-mail：784788532@q.com