基于網絡藥理學探討甘麥大棗湯抗抑郁的作用機制

胡文悅 韓振蘊 常澤林 景峰 馬華萍 王振亦

摘要 目的：研究基于網絡藥理學探討甘麥大棗湯抗抑郁的作用機制。方法：應用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、中藥分子機制生物信息學分析エ具庫（BATMAN-TCM）及文獻搜索獲取甘草、小麥、大棗的活性成分及作用靶點，從Genecards數據庫獲得抑郴癥靶點，獲得藥物疾病交集靶點，通過String在線平臺數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，并利用Cytoscape軟件進行可視化及拓撲學分析篩選核心基因，應用DAVD數據庫完成基因本體（CO）功能與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路的富集分析。結果：共篩出中藥活性成分94個，有效靶點49個，藥物疾病交集靶點48個。PPI網絡發現ALB、CASP3、VEGFA、MYC、CCNDI、ESRI、CTNNBI、AR等可能是關鍵靶點。GO功能富集分析得到181個生物過程，主要涉及雌激素反應、膽堿能突觸傳遞等。KEGG通路富集分析發現46個通路，主要集中在癌癥相關通路、甲狀腺激素信號通路、PI3KAKT信號通路、Wmt信號通路等。結論：本研究為甘麥大棗湯的藥效物質基礎的進一步研究提供了理論基礎，同時為其在抗抑郴方面的應用提供了參考依據。

關鍵詞 甘麥大棗湯;抑郁;藥食同源;網絡藥理學;作用機制;信號通路;靶點;富集分析

中圖分類號：R285

文獻標識碼：A

doi：10.3969/[J].is.1673-7202.2021.21.008

隨著社會進步，人們壓力普遍增大，精神心理狀態從童年成長到晚年生活均被各種原因不同程度地影響著，以情緒低落、興趣減退、思維遲緩等為主要表現的抑郁障礙發病率逐年遞增，抑郁癥患病率高、復發率高、致殘率高，導致了嚴重的社會經濟負擔，有效安全的治療方案還在繼續研究中。有研究發現，在重癥抑郁發生前很多人存在著閾下抑郁狀態，閾下抑郁與抑郁癥有著相似的程度和相對較輕的病理變化，國內外閾下抑郁發病率約14%左右?，及時干預閾下抑郁能夠減少患者向重癥抑郁轉變，但傳統抗抑郁藥物存在著不良反應多的問題，中醫藥食同源方劑很可能是未病狀態更易被接受的治療藥物。

抑郁屬中醫“郁證”“臟躁”范疇，《金匱要略》有“婦人臟燥，喜悲傷欲哭泣，象如神靈所作，數欠伸，甘麥大棗湯主之”的描述，甘麥大棗湯是中醫臨床治療臟躁的經典方，可養心安神、柔肝緩急，在中醫各類情志病中都發揮著重要的作用。有學者認為該方可作為防治情志病的基礎方4，常與其他中藥形成復方組合出現在情志病臨床治療中。有研究發現甘麥大棗湯可以改善抑郁評分，雖然針對抑郁癥人群單用療效并不優于抗抑郁藥，但不良反應很少，而且與抗抑郁藥合用后明顯優于單用抗抑郁藥，是抗抑郁潛力藥物?！岸喑煞?多層次-多靶點-多通路”是中藥治療疾病的特色，但也是現代科學解釋療效作用的難點。由生物信息學、系統生物學等多學科交又而成的網絡藥理學擁有解釋中藥復方作用機制的優勢718，目前甘麥大棗湯抗抑郁機制研究均為某一條或某幾條通路，系統研究較少，故本研究選用網絡藥理學方法探討甘麥大棗湯抗抑郁機制，為其今后在防治抑郁方面的應用提供方向與思路資料與方法

1.1藥物活性成分、作用靶點獲取與篩選檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chi-nese Medicine Systems Pharmacology Database andA-nalysis Platform，Tcmsp）（https：//tcmspw.comtcms.plhp）及中藥分子機制生物信息學分析工具庫（Bioinformatics Analysis Tool of Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）（ht-p：//bone.naps.org/batman-tcm/）獲得甘草、小麥、大棗的化學成分，以口服生物利用度（Oral Bio-availability，OB）≥30%、類藥性（DrugLikeness，DL）≥0.18作為篩選條件，由于抑郁癥存在血腦屏障功能失調，因此將血腦屏障（Blod-Brain Barrier，BBB）設置為≥-0.3，同時作為限制條件，獲取甘麥大棗湯活性較高的化合物。通過ICMSP得到有效成分對應的蛋白作用靶點，并根據已發表的文獻報道補充未預測到的活性化合物及靶點。將篩選得到的活性成分靶點蛋白用Uniprot蛋白質數據庫（htps：//www.uniprot.org）轉化為規范基因名，去重并去掉無對應靶點的活性成分后，使用Cytoscape3.7.2軟件構建活性成分-靶點網絡圖并進行拓撲學分析。

1.2藥物-疾病交集靶點獲取、網絡構建及可視化以“Depression”為關鍵詞檢索GeneCards數據庫（htes：//ww.genecards.org），獲取抑郁相關靶點。將藥物靶點與疾病靶點取交集，通過韋恩圖形式呈現交集靶點。再將交集靶點上傳String在線數據庫平臺（htps：//string-db.org）構建蛋白質-蛋白質相互作用（ProteinProteinInteraction，PPI）網絡模型，將生物種類設定為“HomoSapiens”，最小互相作用國值設定為“MediunConfidence=0.4”，隱藏不相連蛋白，其余設置均為默認設置，得到PPI網絡，上傳至Cytoscape3.7.2軟件進行可視化。

1.3網絡拓撲學分析及核心靶點獲取應用Cyto-scape3.7.2對PPI網絡進行拓撲分析，并以≥1倍介度、緊密度的中位數和≥2倍連接度的中位數為條件篩選核心靶點。

1.4基因本體功能富集分析及京都基因與基因組百科全書通路分析為進一步明確藥物與疾病交集靶點具體的功能及其在相關通路中的作用，將交集靶點上傳至DAVID數據庫6.8版（htps：/david.cifer：.gow/）。以人類為研究對象，應用DAVID數據庫將“甘麥大棗湯”的有效作用靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）功能分析以了解靶點主要的作用過程，京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGC）通路分析觀察靶點在通路中的分布情況。以P《0.05進行靶基因篩選，得到甘麥大棗湯主要生物過程和藥理作用機制中的可能通路，并進一步篩選與抗抑郁相關的信號通路。

2結果

2.1甘麥大棗湯有效成分及作用靶點檢索TCM SP數據庫、BATMAN-TCM數據庫及手工文獻并篩選后，共獲得候選化合物94個，其中，甘草69個，小麥7個，大棗18個，按OB值從大到小前15名進行排位。獲得有效靶點49個，將藥物成分-有效靶點數據集導入Cytoscape3.7.2并進行拓撲學分析，得到中藥成分-作用靶點網絡圖，拓撲學分析Degree值前3名分別為小麥與大棗共有成分B-谷甾醇（Degree=34）、甘草中的7-甲氧基-2-甲基異黃酮（De-gree=16）和甘草査爾酮A（Degree_=15），體現了方劑中藥物協同發揮作用的特點。見表1，圖1。

2.2藥物-疾病靶點獲取、網絡構建及可視化分析

通過Gene Cards數據庫得到抑郁相關靶點11478個。將49個藥物靶點與11478個抑郁疾病靶點取交集得到48個交集靶點，以韋恩圖形式呈現。將得出的48個靶點上傳至String在線平臺數據庫（htps：//string-db.org），構建PI網絡模型，將生物種類設定為“HomoSapiens”'，最小互相作用閾值設定為“Mediun Confidence=0.4”，隱藏不相連蛋白，其余設置均為默認設置，得到PPI網絡，并使用Cytoscape3.7.2軟件可視化，去除游離節點后，圖中47個節點為關鍵蛋白靶點，線條代表蛋白間相互作用，節點越大越亮，度（Degree）越大，線越粗越暗，Combined-score分值越高。見圖2～3。

行拓撲分析，網絡節點的介度、緊密度和連接度的中位數分別為0.00596293、0.484210539，以≥1倍介度、緊密度的中位數和≥2倍連接度的中位數為條件篩選得到8個核心靶點，分別為ALB、CASP VEGFA、MYC、CCNDI、ESRI、CTNNB1、AR，提示這些核心作用靶點相互作用緊密，在網絡中起到關鍵作用。見表2。

2.4GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

2.4.1G0功能富集分析GO功能富集分析得到181個條目（P《0.05），包括生物過程（Biological Process，BP）條目113個，細胞組分（Cell ComponentCC）條目18個，分子功能（Molecular Function，MF）條目50個，每項按P值大小排序取前15條，靶點主要分布在細胞的突觸后膜、突觸、核漿等，而靶點作用包括藥物結合、乙酰膽堿和類固醇受體活性等，而參與的主要生物學過程則包括雌激素反應、膽堿能突觸傳遞及乙酰膽堿受體相關信號通路等。見圖4。

2.4.2KEGG通路富集分析通過KEGG通路富集分析，以P《0.05為篩選條件，共篩選出作用通路46條，主要有癌癥相關信號通路、甲狀腺激素信號通路、刺激神經組織的中的交互、膽堿能突觸、細胞凋亡、催乳激素信號通路、PI3K/AKT信號通路Wnt信號通路等。P值最小前20條見圖5。

3討論

甘麥大棗湯臨床應用較廣，有一定抗抑郁療效，且其作用有多靶點、多層次作用的特點"。實驗研究發現，單用或合用甘麥大棗湯可以從影響單胺類等神經遞質、神經內分泌過程、免疫功能及神經可塑性等多個方面改善抑郁"1，具體作用通路有部分得到驗證而更多需要探索和實驗。本研究采用網絡藥理學方法探討甘麥大棗湯抗抑郁可能的作用靶點及通路，篩選的甘麥大棗湯成分對應的49個作用靶點中，48個與抑郁癥疾病靶點重合，提示甘麥大棗湯在抗抑郁方面可能有相對契合的靶點基礎。

中藥成分中，作用靶點最多的有B-谷甾醇、7-甲氧基2-甲基異黃酮和甘草査爾酮A。研究表明，β谷甾醇可調節下丘腦-垂體-腎上腺素軸（Hypothalamic Pituitary Adrenergic Axis，HPA）]，可提高腦內5-HT含量，可能通過影響神經遞質及神經內分泌機制來發揮抗抑郁作用。而7-甲氧基-2-甲基異黃酮和甘草査爾酮A均屬于黃酮類化合物，該類化合物可通過血腦屏障作用在中樞神經系統，且部分被驗證可通過影響單胺類遞質、調節HPA軸來發揮抗抑郁作用。

靶點方面，經分析發現甘麥大棗湯抗抑郁主要通過ALB、CASP3、VEGFA、MYC、CCND1、ESRI、CT-NBI、AR發揮作用。研究表明，抑郁動物模型存在星形膠質細胞足周圍血管完整性被破壞的表現，BBB通透性會隨之發生改變，而修復BBB后，BBB通透性恢復正常則抑郁癥狀也能得到相應的改善，另有研究表明白蛋白（Albumin，ALB）可以通過營養膠質細胞及其周圍血管內皮細胞來起到改善B通透性的作用，甘麥大棗湯可能通過作用于ALB發揮改善BBB通透性來改善抑郁，同時ALB也承擔著運輸藥物分子的任務，使藥物成分在體內發揮作用，這可能也是甘麥大棗湯與抗抑郁藥合用有更好療效的可能原因。

CO及KEGG分析得到甘麥大棗湯可能通過在膽堿能突觸、多巴胺突觸、類固醇激素作用過程，神經活性的配體-受體相互作用以及與細胞增殖、凋亡和神經可塑性相關的P3K/AKT信號通路、Wnt信號通路、ErbB信號通路、CAMP信號通路、神經營養因子信號通路中作用而起到改善抑郁的效果。本研究得到的核心靶點除ALB外其余靶點均在神經可塑性相關調節中發揮一定作用，故下面就神經可塑性相關通路進行細節討論。

神經營養因子假說是抑郁機制研究熱點之該假說認為神經營養因子相關通路對突觸可塑性神經元生長再生等方面起著重要作用，而通過對這系列通路的調節可以改善抑郁，包括幫助多巴胺能神經元、5-羥色胺能神經元等神經元的生長成活，對海馬、下丘腦等情緒行為相關腦區的營養支持，對神經元再生、調亡以及突觸可塑性調節等作用02。相關通路見圖6～7。

由圖6可知，該系列通路從BDNF與受體酪氨酸激酶受體B（TrKB）特異性結合開始，該過程可使環磷腺苷（CAMP）反應元件結合蛋白CREB磷酸化，從而增加BDNF的轉錄和合成，增強效應作用。同時，下游多條通路級聯反應發生，包括ERK通路、PI3K/AKT通路及PKC通路等，這3個通路均可以通過一系列反應最終激活CREB而更多地產生BDNF。同時，例如，本研究得到的比較集中（靶點較多）且P值較小的PI3K/AKT通路，從包括P3K T-mTOR、P3KAKT-CSK-3β通路效應從而促進細胞再生、調控細胞周期，從PI3K/AKT-Bcl-2-Capase3調控細胞凋亡，從下游VEGF信號途徑及MAPK信號途徑完成細胞增殖、血管生成及DNA修復功能等，最終改善抑郁癥狀。既往有實驗證明，含甘麥大棗湯的方劑能夠通過調控AKT-mTOR及CSK3β發揮類似氯胺酮的抗抑郁作用，而甘草也被證明能夠顯著降低抑郁大鼠海馬區凋亡效應蛋白Caspase-3的表達同時升高抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達。有研究表明，中藥也可能通過調節VECF通路影響eNOS表達從而改善抑郁大鼠血管內皮細胞同時起到抗抑郁的作用。本研究篩選得到的8個核心靶點中，CASP3、VEGFA、MYC、CC NDI都在上述通路中發揮著重要作用，而AR與ESRI1是雌激素及雄激素相關的蛋白質，它們的作用也可能與該系列通路相關，有研究表明，圖6所示的ESR1/2通路是雄激素與雌激素發揮抗抑郁效果的可能途徑，甘麥大棗湯的核心靶點中包含了存在性別差異的2種激素靶點，從機制上講，也許可以更好地保證甘麥大棗湯作用療效無性別差異。

有研究認為，細胞外NMDA受體被谷氨酸能神經遞質過度激活是導致BDNF降低的關鍵機制之一，而也有研究表明，越鞠甘麥大棗湯可以調控NMDA受體表達增強突觸可塑性20，但是否是由甘麥大棗湯原方發揮主要作用需要進一步研究。通路分析中，還有一條Wnt信號通路，甘麥大棗湯核心靶點中CT'NNBL基因編碼蛋白產物是β連接蛋白，而Wntβ-連接蛋白通路可以促進神經元再生的經典通路，且這條通路與BDNF通路可能通過CSK3B建立聯系2，互相影響彼此調控，起到改善抑郁的作用;有研究表明甘草可影響頗腦損傷大鼠Wnt/B-連接蛋白通路基因表達，具體抑郁相關機制有待進一步驗證及研究。

本研究通過網絡藥理學方法探究甘麥大棗湯抗抑郁機制，展示中藥方劑多成分、多靶點、多通路的作用機制，得到的一些通路和核心基因已經得到驗證，而VEGFA信號通路、AR與ESRI相關的ERKI/2信號通路、Wmt/β-連接蛋白通路等需要未來繼續相關探索，同時甘麥大棗湯原方與其單藥、藥物主要成分及其加減方在PI3K/AKT-mTOR通路、P3K/AKT-CSK-3β通路、NMDA受體表達通路的效應也需要對照試驗明確。甘麥大棗湯作為藥食同源經典方，在抗抑郁方面的開發有著廣闊的前景，特別是針對機制與重癥抑郁類似的抑郁病前狀態一國下抑郁的干預，經過未來研究明確其療效及機制，有望開發更安全、更易被亞健康人群接受的產品，造福更多人。

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（2020-11-23收稿責任編輯：魏慶雙，徐穎）

基金項目：國家重點研發計劃項目（2019YFC1710103）

作者簡介：胡文悅（1995.07-），女，博士研究生在讀，研究方向：中醫腦病的臨床與基礎研究，E-mail：maryhuyy@163.com

通信作者：韓振蘊（1975.03-），女，博士，主任醫師，博土研究生導師，研究方向：中醫腦病的臨床與基礎研究，E-mail：tohanzhenyun@sima.com