不同濃度胰島素對雞胚盲腸上皮細胞生長的影響

張 琦，史文倩，段步婷，崔小珍，郭露露，張 昱，鄭明學，白 瑞

（山西農業大學動物醫學學院，山西太谷030801）

雞球蟲病是由9 種艾美耳球蟲引起，侵入雞腸上皮細胞引發的一種寄生性原蟲病[1]。全世界每年因雞球蟲病造成的經濟損失巨大[2]。其臨床癥狀主要為血痢，腸道受損[3]。9 種雞球蟲中，以柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）的危害最大，主要侵害盲腸[4]。目前，大多研究者進行柔嫩艾美耳球蟲體外研究時，主要用原代雞腎細胞和肺上皮細胞作為細胞模型，而柔嫩艾美耳球蟲真正的宿主細胞是盲腸上皮細胞[5]。因此，為了進一步研究柔嫩艾美耳球蟲入侵和損傷機制，進一步研制阻斷柔嫩艾美耳球蟲入侵和損傷宿主細胞的藥物，需要建立一個雞胚盲腸上皮細胞（Chick embryo cecal epithelial cells，CECECs）的體外培養模型。

胰島素是由胰島B 細胞受到內源性或外源性物質（葡萄糖、核糖、胰高血糖素等）的調節，經過胞吐方式分泌的一種蛋白質類激素[6]。它的作用主要有增強合成代謝及生長發育、維持糖代謝穩態與能量平衡[7]。胰島素是一種在一定濃度內可促進細胞生長的關鍵性生長因子，能夠調節糖類、蛋白質的分解利用[8]，從而促進細胞的增殖分化[9]，是一些細胞合成培養基中必不可少的成分。目前，確認的胰島素生物效應是通過調控活化細胞中的蛋白激酶、磷酸酶等級聯反應來實現促進細胞增殖的功能[10]。胰島素發揮生物效應的主要信號通路有2 條，一是Ras 途徑，二是磷脂酰肌醇3 激酶通路[11]，其作用機制為：胰島素和細胞膜上的胰島素受體（IR）結合進而激活酪氨酸激酶的活性，使受體底物（IRS）磷酸化，募集含有SH2 功能域的信號蛋白，最終發揮調控細胞生長、分化的作用[12]。

本研究對體外生長的CECECs 加入不同濃度的胰島素，觀察該細胞生長狀況，通過比較CECECs克隆形成率、生長曲線等指標，分析不同濃度胰島素的作用，確定培養基生長因子的最佳濃度，以便更好地構建體外CECECs 生長模型。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 16 日齡SPF 雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.1.2 試劑 DEME/F12 培養基、谷氨酰胺、0.25%胰酶 -EDTA 均購自 Gibco公司；角蛋白 18（CK-18）、DAB 顯色劑、表面生長因子（EGF）、二甲基亞砜（DMSO）均購自Sigma 公司；胰島素、氫化可的松、青鏈霉素混合液、嗜熱菌蛋白酶均購自Biolegend公司；纖連蛋白、肝素鈉、MTT 試劑盒、PBS、0.4%臺盼藍、丙氨酸鈉均購自Solarbio 公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司；山羊血清、羊抗鼠IgG均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞胚盲腸上皮細胞的分離和原代培養 取16 日齡的SPF 雞胚，在無菌條件下分離盲腸，去除腸系膜及周圍結締組織，用含雙抗PBS 緩沖液漂洗5 次，每次3 min。剪成約1 mm3組織塊，置于50 μg/mL 的嗜熱菌蛋白消化酶中，并將其置于振蕩培養箱（37 ℃，80 r/min）中恒溫振蕩消化2 h。待消化完成后，置于低溫離心機中1 000 r/min 離心5 min。棄去上清，將沉淀在含10%胎牛血清的細胞培養基中重懸，輕輕吹打混勻，然后將細胞懸液接種于細胞培養瓶內，41 ℃，8%CO2的培養箱中培養70 min，貼壁差便于去除成纖維細胞。收集細胞培養液，1 000 r/min 離心5 min，沉淀在含2.5%胎牛血清的細胞培養基中重懸，并計數，按20 萬/孔的細胞接種于細胞培養板中，將培養板置于41 ℃，8%CO2的培養箱中培養，每2 d 換液一次[13]，倒置熒光顯微鏡對細胞進行觀察拍照。

1.2.2 胰島素對雞胚盲腸上皮細胞克隆形成率的測定 將長勢較好、處于對數生長期的細胞先用0.25%的胰蛋白酶-EDTA 消化，然后將細胞懸液接種于2.5%的胎牛血清培養基中。設置每組胰島素的質量濃度分別為 5、10、15、20 μg/mL，并設置對照組胰島素質量濃度為0 μg/mL，每一個濃度設置3 個孔。各組以50、100、200 個細胞的梯度倍數稀釋懸浮液分別接種于10 mL 培養皿中，輕輕轉動培養皿使細胞分布均勻，置于 CO2培養箱（41 ℃，8%CO2）中培養14 d。每天觀察培養皿中細胞的生長狀況，當觀察到有明顯的細胞克隆現象時，停止對細胞的培養，將上清液吸棄至廢液缸，再用PBS 沖洗貼壁細胞2 次，用4%的甲醛固定15 min，棄去固定液，然后用姬薩姆染色液染色20 min，流動水沖洗掉染色液，自然風干。倒置培養皿并在培養皿上加一張透明的網格紙，在顯微鏡下觀察，計數大于10 個細胞的克隆數，最后計算克隆形成率。

1.2.3 雞胚盲腸上皮細胞生長曲線（率）的測定分別將不同濃度胰島素配制雞胚盲腸上皮細胞生長的培養基，用96 孔細胞培養板每孔接種2×104個細胞，進行孵育培養，連續8 d 用MTT 法測定細胞活力，取3 組平行數據，用酶標儀于490 nm 處測定吸光度值，并根據測定結果繪制各組盲腸上皮細胞的生長曲線。

1.2.4 上皮細胞角蛋白18（CK-18）鑒定 將原代的雞胚盲腸上皮細胞懸液接種于鋪有細胞爬片的6 孔板中，41 ℃，8%CO2條件下培養，待細胞貼壁率為80%時，用PBS 緩沖液沖洗已爬片的細胞3 次。用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 洗滌3 次；室溫滴加山羊血清處理20 min；加入CK-18 一抗，37 ℃孵育2 h，PBS 洗滌3 次；然后加入羊抗鼠二抗，避光37 ℃孵育 1 h，PBS 洗滌 3 次；DAB 顯色，PBS 洗滌3 次。蘇木精復染，封片。顯微鏡下觀察染色結果。

1.3 數據處理

試驗數據用SPSS Statistics v25.0 統計學軟件進行單因素ANOVA 方差分析，結果均用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 雞胚盲腸上皮細胞的形態學觀察

在CECECs 培養基中加入不同濃度的胰島素，培養72 h 后在倒置顯微鏡下觀察上皮細胞。培養基中不添加胰島素時，視野下細胞數較少且呈圓形，細胞散在分布（圖1-A）。添加5 μg/mL 的胰島素時，細胞數量增多，聚集生長呈島嶼狀分布，少數細胞呈散在分布（圖1-B）。添加10 μg/mL 的胰島素時，細胞數量顯著增多，密度增加，細胞之間緊密連接，均勻分布（圖1-C）。添加15 μg/mL 的胰島素時，細胞數量減少，聚集成島嶼狀的細胞減少，呈散在分布，細胞呈圓形或橢圓形（圖1-D）。添加20 μg/mL的胰島素時，細胞數量顯著增多，多數呈聚集分布，少數散在分布（圖1-E）。培養7 d，CECECs 呈典型的鵝卵石樣（圖1-F）。

2.2 胰島素對CECECs 克隆形成率的測定結果

由圖2 可知，與不添加胰島素組（CK）相比，5 μg/mL 的胰島素對雞胚盲腸上皮細胞克隆形成有明顯促進作用。胰島素在10 μg/mL 時，盲腸上皮細胞克隆形成效果最顯著，細胞增長形成率明顯增高，差異達極顯著（P＜0.01）。胰島素在 15 μg/mL 時，盲腸上皮細胞克隆形成率略有增高，但與10 μg/mL組的細胞克隆形成率間差異不顯著（P＞0.05）。胰島素在20 μg/mL 時，盲腸上皮細胞克隆增長率依然略有增高，但與15 μg/mL 組間差異不顯著（P＞0.05）。因此，10 μg/mL 是促進細胞克隆形成的最佳質量濃度。

2.3 雞胚盲腸上皮細胞生長曲線的測定結果

從圖3 可以看出，體外培養的雞胚盲腸上皮細胞，各組細胞1～2 d 生長緩慢，第3 天開始進入倍增生長期，添加胰島素 10、15、20 μg/mL 組生長至第5 天達到細胞平臺期，之后生長較為緩慢，且組間差異不顯著（P＞0.05）。但與不添加胰島素組（CK）、5 μg/mL 胰島素組間差異達極顯著 （P＜0.01），細胞生長活力旺盛。

2.4 雞胚盲腸上皮細胞CK-18 免疫細胞染色結果

采用免疫細胞染色法鑒定分離培養的細胞中CK-18 的表達，結果顯示（圖4），細胞呈上皮細胞特有的角蛋白陽性。說明本試驗分離得到的細胞表達了CK-18，具有上皮細胞的典型特征，表明生長克隆的細胞為CECECs。

3 結論與討論

胰島素是一種具有同化作用的生長因子，是細胞分裂和代謝的重要調節因子。胰島素能夠促進蛋白質的合成以及葡萄糖的氧化分解，釋放能量供機體利用，從而刺激細胞的增殖分化[15]。胰島素對DNA、RNA、ATP 的合成有促進作用[16]，有利于細胞的生長。GUNAWARDANA 等[17]研究表明，添加胰島素能夠減少凋亡和促進增殖，但同時存在劑量依存性。謝明權等[18]研究表明，胰島素具有促進原代雞腎細胞的生長和促進球蟲卵囊形成的作用。于宇翔等[19]研究表明，胰島素樣生長因子（IGF-I）能夠調節RNA 和DNA 的合成，促進小鼠睪丸間質細胞增殖和分化。在本試驗中，在體外培養基中加入了不同濃度的胰島素培養孵育72 h，隨著胰島素濃度的增加，雞胚盲腸上皮細胞的增殖效應和克隆形成率也逐漸增加。當胰島素質量濃度為10 μg/mL 時，盲腸上皮細胞的增殖效應最顯著，細胞克隆形成率最高。與 10 μg/mL 組相比，雖然 15、20 μg/mL 組的細胞克隆形成率有所增高，但差異不顯著（P＞0.05）。因此在本研究中，10 μg/mL 胰島素是促進雞胚盲腸上皮細胞生長增殖的最佳質量濃度。這為進一步研究雞球蟲對雞盲腸侵害的機制有很大幫助。

CK-18 是一種特異性骨架蛋白，存在于上皮細胞表面[20]，對于維持上皮組織的完整性及連續性起著重要作用[21]。研究表明，CK-18 具有高度的保守性和組織分化特性，與上皮細胞的增殖分化密切相關[22]。CK-18 作為上皮細胞表面的特異性蛋白質，常被用于檢測上皮來源的細胞[23]。尹博文等[24]通過細胞角蛋白免疫熒光染色鑒定，確定得到了樹鼩小腸上皮細胞。洪智敏等[25]選用鼠抗雞CK-18 單克隆抗體對培養的上皮細胞進行免疫組化鑒定，確定所培養的細胞為雞胚小腸上皮細胞。本研究中，利用CK-18 免疫細胞染色法鑒定培養的細胞呈陽性，確定為CECECs，且具有上皮細胞的典型特征。

本研究結果表明，一定濃度的胰島素可以促進雞胚盲腸上皮細胞的增殖和生長。通過對該細胞克隆形成率和細胞生長曲線的測定發現，10 μg/mL 的胰島素對雞胚盲腸上皮細胞生長有顯著的促進作用，并且用免疫細胞染色法鑒定本試驗中培養的細胞為雞胚盲腸上皮細胞。這為建立一個完善的體外雞胚盲腸上皮細胞培養體系以及進一步研究雞球蟲的損傷機制奠定了基礎。