小分子RNA干涉技術在農(nóng)作物基因沉默中的應用現(xiàn)狀

焦健王義春

(1.中國科學院科技戰(zhàn)略咨詢研究院，北京 100190；2.山東濱州陽信縣綜合檢驗檢測中心，山東 濱州 256600)

引言

近年來，隨著生命科學領域研究的日益深入，長度約為20～30個核苷酸(20～30nucleotide [nt])的非編碼小RNA(small noncoding RNA sRNA)分子被科研工作者發(fā)現(xiàn)。通過對sRNA特征和功能的研究，發(fā)現(xiàn)這些sRNA參與了生物體基因和基因組各個信號通路的調(diào)控過程，其重要性不言而喻。根據(jù)sRNAs的起源、結(jié)構(gòu)特征、相關的效應蛋白和生物學功能，可將sRNAs分為2個主要的類別，即siRNAs(short interfering RNAs)和miRNAs(microRNAs)。這2類sRNAs的發(fā)現(xiàn)，向人們揭示出，動植物的基因組非編碼區(qū)亦蘊含著極其重要的作用和功能。siRNA和miRNA參與調(diào)控了動植物的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化、染色體的遷移、轉(zhuǎn)錄重編程、蛋白質(zhì)的翻譯以及RNA加工和穩(wěn)定性保持等重要的生物學過程。

1 sRNA的起源和合成機制

1.1 siRNA和miRNA的起源

miRNA最早是由Ambros及其同事，于1993年在研究控制線蟲幼蟲時序性發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的，當時被命名為一個內(nèi)源調(diào)控基因lin-4[1]。5a后，Mello和Conte報道了有關外源雙鏈RNA分子(double-stranded RNA，dsRNA)通過RNA干涉(RNA interference，RNAi)的機制，可以導致基因的特異沉默[2]。1999年，Tomariand和Zamore證明了植物中的基因沉默機制是通過長度約為20～25nt的siRNAs與靶標基因的堿基互補配對實現(xiàn)的[3]。隨后不久，研究證明dsRNA分子可以直接轉(zhuǎn)換為長度約21～23nt的siRNAs；在多種動植物物種中，miRNA介導的生物學作用被廣泛報道。至此人們認識到：miRNA作為內(nèi)源基因的調(diào)控子，而siRNA則通過阻止外源核苷酸的干擾(如病毒的感染、轉(zhuǎn)座子的活動和轉(zhuǎn)基因的影響)來保護生物基因組的完整性。

1.2 siRNA和miRNA的合成機制

sRNA的生物合成是在多種基因元件的精細調(diào)控下完成的。通過對其生物合成調(diào)控網(wǎng)絡的詳細研究，發(fā)現(xiàn)了參與其中的許多主要組分，如，RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ)、Dicer蛋白酶家族、依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)、Argonaute蛋白、HEN1以及HST蛋白[4]。

siRNA和miRNA在生物合成機制中，存在以下3個不同點。miRNA是來源于生物體本身內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄物，并且是受時空調(diào)節(jié)、有目的性表達的；siRNA主要來自生物體外部，如外源病毒基因組和外來轉(zhuǎn)基因，只有少部分來自于內(nèi)源的轉(zhuǎn)座子基因。miRNA是從不完全互補配對的雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體切割產(chǎn)生；siRNA則來自較長的完全互補配對的雙鏈RNA(double-stranded RNAs，dsRNAs)分子。成熟的siRNA分子主要以雙鏈形式存在，并且以堿基完全互補配對的方式與其靶標基因結(jié)合；成熟的miRNA分子均為單鏈，與靶標基因的結(jié)合也并不是完全互補的，存在1～3個堿基的錯配。

盡管存在上述差異，但siRNA和miRNA由于在產(chǎn)物大小方面和以序列特異的沉默方式方面極其相似，預示著兩者的生物合成和作用機制存在必然聯(lián)系。已有研究證明，siRNA和miRNA在生物合成過程和作用機制中，均依賴于兩類蛋白家族成員——Dicer酶和Argonaute蛋白。其中，Dicer酶負責siRNA和miRNA前體的剪切，最終形成成熟的sRNA分子；AGO蛋白(Argonaute protein)在這兩類小RNA的沉默發(fā)生機制中，與siRNA和miRNA形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，即siRNA-RISC和miRNA-RISC，并發(fā)揮核心作用。因此，Dicer酶、AGO蛋白與長度約為20～23nt的雙鏈sRNAs形成了RNA干涉機制中的核心結(jié)構(gòu)特征(圖1)[5]。

圖1 siRNA和miRNA相似的合成和干涉機制[5]

2 sRNA在作物中的生物學功能

2.1 siRNA在作物中的生物學功能研究簡介

siRNA參與了農(nóng)作物生長發(fā)育、生物脅迫、非生物脅迫及代謝途徑等多種生物學過程，具有重要的生物學功能。在轉(zhuǎn)基因煙草中表達dsRNA以產(chǎn)生siRNA，可有效抑制PMMoV (Pepper mild mottle virus)的侵染，表明siRNA在提高植物抗病毒方面起重要作用[6]。siRNA還可以通過降解衛(wèi)星RNA(Satellite RNAs)或缺陷干涉RNA(Defective interfering RNAs)，顯著提高本生煙的抗性[7]。還有報道證實，煙草黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)可利用病毒衛(wèi)星RNA產(chǎn)生siRNA，能有效降解寄主煙草中與RNAi相關的基因元件，以防止被寄主RNAi機制干擾病毒自身的生長發(fā)育[8]。此外，Wesley等利用RNAi載體轉(zhuǎn)化禾本科作物大麥，通過產(chǎn)生siRNA使新轉(zhuǎn)基因大麥品種對黃矮病毒產(chǎn)生持久抗性[9]。因此，通過siRNA介導的沉默技術結(jié)合其它育種技術，可為改良作物品種提供一種有效的技術方法。

2.2 miRNA在作物中的生物學功能研究簡介

miRNA介導的基因沉默是農(nóng)作物體內(nèi)天然存在的一種防御體系，利用這一體系，可有效抵抗病毒、細菌或真菌病害的侵染。方榮祥研究報道，利用amiRNA靶向黃瓜花葉病毒(CMV)的沉默抑制因子2b，可以有效提高轉(zhuǎn)基因煙草對CMV抗性[10]。另外，對大豆Glyma18g02680.1基因通過amiRNA沉默，導致了對大豆線蟲病害抗性的明顯增強[11]。孫其信實驗室通過對普通小麥進行白粉病接種處理或熱激處理，結(jié)合Solexa高通量測序，鑒定出了24個與小麥白粉病反應相關及12個與熱激反應相關的miRNA。而這些miRNA是否真正參與了小麥白粉病抗病過程及非生物熱激脅迫過程，仍需進一步深入研究[12]。此外，通過利用高通量測序法，預測到了58個品質(zhì)較好的面包小麥miRNA和70個候選的普通小麥保守miRNA，其中23個通過比對得到互補配對的miRNA*序列，可以確定屬于小麥的天然miRNA。對于大麥miRNA的研究方法與小麥方面幾乎一樣，都是通過預測、高通量測序或深度測序再比對的方法，目前已經(jīng)得到175個大麥miRNA和234個小麥miRNA，有些是植物不同物種間相對保守的，而有些是麥類作物或者單子葉植物特有的miRNA[13]。miRNA也同樣參與了農(nóng)作物生長發(fā)育調(diào)節(jié)的過程。如，水稻中利用miRNA抑制不同基因的表達，如Phytoene desaturase(PDS Os03g08570)、Spotted leaf 11(Spl11 Os12g38210)和Elongated uppermost internode1/CYP714D (Eui1 Os05g40384)，導致了水稻葉片光漂白表型[14]。

3 VIGS技術及其在作物功能基因組學中的應用

3.1 VIGS技術簡介

由于農(nóng)作物突變體的收集獲得較難，基因沉默已經(jīng)成為一種有效的研究功能基因組學的反向遺傳學工具。病毒誘導的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)作為一種PTGS現(xiàn)象，是作物基因組功能分析的重要技術手段。即在已改造、優(yōu)化的病毒載體中，插入適當大小的目的基因cDNA片段，隨著病毒侵染寄主并在作物組織中大量繁殖后，病毒載體中的目的cDNA片段在作物體內(nèi)利用siRNA的生物合成途徑產(chǎn)生針對靶標基因的多種siRNA，繼而通過siRNA干涉機制，降解靶標基因的mRNA，最終實現(xiàn)對目的基因轉(zhuǎn)錄水平的沉默或翻譯水平的抑制[15]。如圖2所示[16]，VIGS的基本過程包含病毒載體的構(gòu)建、寄主作物的病毒侵染、產(chǎn)生sRNA并啟動對目標基因的干涉機制。

圖2 VIGS的流程示意圖[16]

3.2 VIGS病毒載體在作物中的應用

瞬時VIGS在實際應用時需要高侵染效率、高表達、易操作且穩(wěn)定的病毒載體。經(jīng)過近年來相關領域的不斷發(fā)展，研究者成功開發(fā)出了多種病毒載體并相繼對其進行了合理改造和優(yōu)化，形成了一系列可分別在單、雙子葉作物中應用的VIGS病毒載體。如，大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)可在單子葉植物中有效實現(xiàn)靶標基因的沉默[14,15]。對于單子葉作物而言，基因功能抑制的研究手段不多且較困難，VIGS作為一種反向遺傳學的手段極大地促進了單子葉作物功能基因組的研究，為麥類、水稻和玉米等重要經(jīng)濟作物基因功能分析提供了有效的方法。再如，煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)、甘藍葉卷曲病毒(Cabbage leaf curl virus，CaLCuV)、馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)和衛(wèi)星病毒誘導的沉默系統(tǒng)(Satellite virus-induced silencing system，SVISS)等可在雙子葉植物(煙草、擬南芥和馬鈴薯等)中對目的基因?qū)崿F(xiàn)有效的抑制[17]。

因此，VIGS實驗時應選擇操作簡單、侵染性好、寄主發(fā)病癥狀輕以及病毒癥狀能在植株系統(tǒng)和各個組織中傳播的病毒載體。清華大學劉玉樂教授實驗室于2010年，報道了一種改造后的甘藍葉卷曲病毒(CaLCuV)載體，通過農(nóng)桿菌介導的方式可以有效侵染本生煙植株。該CaLCuV載體不但可以攜帶目的基因的cDNA片段以引發(fā)siRNA介導的基因沉默，而且還可以通過擬南芥AtmiR319前體作為骨架，攜帶人工微小RNA(artificial microRNAs amiRNA)以引發(fā)miRNA介導的基因沉默。并且該系統(tǒng)還可以高表達內(nèi)源miRNA，內(nèi)源AtmiRNA156和AtmiRNA165高表達后，其相應的靶標基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達量明顯下調(diào)。該載體攜帶的amiRNA是由WMD3平臺設計并選擇的，以AtmiR319前體作為骨架，采用Overlap PCR的方法，用適當?shù)腶miRNA∶amiRNA*替換內(nèi)源的miRNA∶miRNA*，并保持原有前體的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)。通過對本生煙八氫番茄紅素脫氫酶PDS基因的沉默，研究了siRNA和amiRNA所介導VIGS的異同及優(yōu)缺點，發(fā)現(xiàn)amiRNA所介導VIGS沉默效果相當于傳統(tǒng)的插入cDNA片段大于300bp所介導沉默的效果，證明CaLCuV∶amiRNA介導的基因沉默更加有效[17]。可見，不論是傳統(tǒng)的表達cDNA片段的沉默方法，還是表達sRNA起到沉默效果，最終都在農(nóng)作物體內(nèi)表達出小分子RNA以實現(xiàn)對目標基因的沉默。

4 結(jié)語

當前，農(nóng)作物改良和育種進入后基因組時代，解讀、編輯與改造農(nóng)作物基因組顯得尤為重要。小分子RNA介導的干涉技術作為一種傳統(tǒng)的反向遺傳學技術，是農(nóng)作物基因組改造與基因功能研究必不可少的手段之一，并且相信可以與基因編輯技術、分子設計育種等新興技術一起，為改良農(nóng)作物品種、保持作物穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、保障糧食安全等諸多涉及國家戰(zhàn)略性的基礎領域和產(chǎn)業(yè)領域，提供有力科技支撐。