基于小熱休克蛋白-細胞穿膜肽蛋白納米粒的siRNA遞送系統

王 浩，劉 寧，陳 麗，崔梅英，王冬梅，劉宇軒，關新剛

(北華大學 醫學技術學院，腫瘤靶向治療重點實驗室，吉林 吉林 132013)

小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)因其為可靶向沉默細胞內的特異性基因，在藥物研發領域已引起人們廣泛關注[1-5]. 但siRNA體內半衰期短、 易降解、 穿膜性差等缺點限制了其在體內的進一步應用[6-8]. 設計開發高效、 安全的siRNA遞送體系成為發揮siRNA治療功效的關鍵因素.

近年來，基于蛋白質[9]、 脂質體[10-11]、 高分子聚合物[12-13]、 無機材料[14]等多種材料的遞送系統已用于siRNA高效率轉運的研究中，其中基于蛋白質材料的siRNA遞送系統因蛋白質材料具有良好相容性和可降解性及可通過基因工程改造等特性已引起人們廣泛關注[15-17]，基于病毒衣殼蛋白的siRNA遞送體系可高效率地遞送，但需考慮載體蛋白的安全性[18]. 非病毒類的蛋白納米籠由于高穩定性、 單分散性、 良好的生物相容性和生物降解性，廣泛用于構筑多功能的藥物遞送系統中，在腫瘤靶向診斷和治療方面取得了重要進展[19]. 小熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)的蛋白納米粒可承受高pH值和高溫等環境，其籠內腔可用于包裹抗癌藥物、 光敏劑和成像劑，籠外表面可修飾功能肽，顯示出作為遞送載體的巨大潛力[20]. 源自詹氏甲烷球菌的Hsp因其24個亞基可自組裝成粒徑均一的空心籠狀結構(外徑13 nm，內徑6.5 nm)而廣泛用于遞送各種藥物和成像分子中[21]. Tat是人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因編碼的反式轉錄激活因子，作為經典的細胞穿膜肽(cell penetrating peptide，CPP)被廣泛用于各種物質的胞內轉運中[22-24]. 本文通過在Hsp基因C末端引入Tat序列，表達純化Hsp-Tat融合蛋白，制備Hsp-Tat納米粒，研究其生物相容性、 siRNA復合及siRNA胞內轉運特性，為高效、 安全的新型siRNA遞送系統研究提供依據.

1 材料與方法

1.1 質粒、 細胞和主要試劑

pET-25b-Hsp-Tat質粒由上海生工公司構建; 大腸桿菌BL21(DE3)和HEK-293T細胞由北華大學腫瘤靶向治療重點實驗室保存; 酵母提取物和蛋白胨、 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、 苯甲基磺酰氟(PMSF)、 氨芐青霉素(Ampicillin)和Ni-NTA親和樹脂(生工生物工程(上海)股份有限公司)； DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)、 DiO(細胞膜綠色熒光探針)和蛋白質標準品(上海碧云天生物技術有限公司)； 活/死細胞活力檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)； Lipo 3000轉染試劑(美國Invitrogen公司)； siRNA及Cy3標記的siRNA(siRNA為不靶向任何基因的陰性對照序列，上海吉瑪制藥技術有限公司)，正向序列: UUCUCCGAACGUGUCACGUTT; 反向序列: ACGUGACACGUUCGGAGAATT.

1.2 Hsp-Tat融合蛋白的原核表達與純化

將pET-25b-Hsp-Tat質粒轉化入E.coliBL21(DE3)感受態細胞，菌液均勻涂布于LB(Luria-Bertani)固體培養基(含Ampicillin)上，于37 ℃溫箱培養過夜. 挑取單克隆菌落接種于LB培養基中，于37 ℃振蕩培養過夜; 第二天按1∶100比例于LB培養基中擴大培養，當菌液OD600=0.5～0.6時，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)繼續誘導6 h. 培養結束后離心收集菌體，重懸后超聲破碎菌體，離心收集菌體裂解液. 用結合緩沖液平衡預裝柱中Ni-NTA樹脂后，加入2倍柱體積的菌體裂解液，于雜交爐4 ℃孵育1 h后收集穿流液，然后加入洗滌緩沖液洗去非特異性結合蛋白，再加入洗脫緩沖液洗脫收集目的蛋白，重復洗脫3次收集洗脫液; 對裂解液的上清液、 穿流液、 洗滌產物和洗脫產物進行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測(POWERPAC型，美國Bio-Rad公司).

1.3 Hsp-Tat納米粒的表征

用納米粒度分析儀(Nanotrac Wave Ⅱ型，美國Microtrac公司)測定純化后Hsp-Tat的粒徑，在測量前將融合蛋白樣品振蕩混勻，用0.45 μm PES(聚醚砜)針頭過濾器過濾，取200 μL樣品加入分析儀測量孔測量. 用場發射透射電鏡(JEM-1011型，日本JEOL公司)檢測納米粒形貌，加速電壓為100 kV.

1.4 Hsp-Tat NP的生物相容性

將HEK-293T細胞于培養皿中培養，加入含體積分數為10%的胎牛血清(FBS)、 100 μg/mL的青霉素和青鏈霉素的DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養基，于φ(CO2)=5%，37 ℃細胞培養箱中孵育. 將HEK-293T細胞以5×103/孔鋪于96孔板上，24 h后將終質量濃度分別為12.5，25，37.5，50，100 μg/mL的Hsp-Tat融合蛋白加入孔板中，每個質量濃度設置5個復孔，孵育48 h. 每孔加入20 μL MTT(噻唑藍，5 mg/mL)孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO(二甲基亞砜)，在酶標儀(Spark 20M型，瑞士TECAN公司)上測量其在490 nm處的吸光度，檢測結果以均值±SD(標準差)表示. 將HEK-293T細胞以5×103/孔鋪于96孔板上，孵育24 h后加入100 μg/mL的Hsp-Tat融合蛋白，繼續培養48 h，棄上清液后用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌2次，加入活/死細胞活力檢測試劑，用激光共聚焦熒光顯微鏡(Axio Imager A2型，德國Zeiss公司)成像.

1.5 Hsp-Tat NP的siRNA復合特性

將Hsp-Tat NP與siRNA按n(Hsp-Tat NP)∶n(siRNA)(N/P)=0,0.39,0.78,1.56,3.13,6.25,12.5,25,50混合在pH=7.4的PBS緩沖液中，于37 ℃孵育1 h，在體積分數為2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀(BDAdigital型，德國耶拿公司)觀察并掃描成像.

1.6 Hsp-Tat NP/siRNA復合物的穩定性

用納米粒度分析儀(Nanotrac Wave Ⅱ型，美國Microtrac公司)連續7 d監測Hsp-Tat NP/siRNA復合物(N/P=50)在0.1 mol/L PBS(pH=7.4)分散體系中的粒徑，每份樣品平行操作3次，檢測結果以均值±SD表示.

1.7 細胞轉染實驗

用熒光素(Cy3)標記的siRNA檢測Hsp-Tat NP的siRNA胞內轉染特性. 將對數生長期的HEK293T細胞接種于具小圓蓋玻片的24孔板中培養24 h. 第二天將20 pmol Cy3-siRNA 與34 μg Hsp-Tat NP按N/P=50進行復合，于37 ℃孵育1 h制備Hsp-Tat NP/siRNA復合物. 以無遞送載體的20 pmol Cy3-siRNA為陰性對照，將20 pmol Cy3-siRNA和1 μL Lipo3000轉染試劑分別與25 μL Opti-MEM混勻，于室溫混合孵育15 min制備Lipo3000/siRNA復合物作為陽性對照. 在孔板中分別加入20 pmol游離siRNA、 按上述方法制備的Lipo3000/siRNA復合物及Hsp-Tat NP/siRNA復合物，于37 ℃孵育4 h后，將孔中培養基替換為含血清的完全培養基，繼續培養24 h. 然后用PBS洗滌細胞2次，并在室溫下用質量分數為4%的多聚甲醛固定20 min，DiO染色5 min，DAPI染色10 min，PBS沖洗3次. 將染色的蓋玻片倒置于載玻片上，封片后用激光共聚焦熒光顯微鏡成像.

2 結果與分析

2.1 Hsp-Tat 融合蛋白的原核表達與純化結果

將Hsp-Tat質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，IPTG誘導6 h后收集細菌，超聲破碎，離心收集裂解液上清液和沉淀. Hsp-Tat蛋白原核表達及純化的SDS-PAGE分析如圖1所示. 由圖1可見，Hsp-Tat融合蛋白主要以可溶性蛋白分布于菌體裂解液上清液(泳道CL)中，為后續利用親和層析柱方法純化蛋白創造了有利條件. 由于Hsp-Tat融合蛋白末端攜帶組氨酸標簽，因此選用Ni-NTA樹脂純化蛋白. Ni-NTA樹脂的3次洗脫液(泳道E1,E2,E3)均檢測到純度較高的單一條帶，相對分子質量與預期相符(25 760)，表明Hsp-Tat融合蛋白制備成功.

CL: 細菌裂解液； FT： 上樣穿流液； W： 洗滌緩沖液；E1～E3： 洗脫緩沖液1～3； M： Marker.圖1 Hsp-Tat蛋白原核表達及純化的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression and purification of Hsp-Tat protein

2.2 Hsp-Tat蛋白納米籠粒徑的表征結果

由于24個Hsp單體亞基可自組裝成直徑為20 nm的空心籠形結構[25]，因此本文檢測了Hsp-Tat融合蛋白的自組裝特性. Hsp-Tat蛋白納米籠粒徑的分布與透射電鏡(TEM)照片如圖2所示. 由圖2(A)可見，Hsp-Tat融合蛋白自組裝納米顆粒(Hsp-Tat NP)的平均粒徑為40.2 nm； 由圖2(B)可見，蛋白納米顆粒為空心球形結構，與文獻[17]中Hsp衍生蛋白自組裝成籠形納米結構一致. 與Hsp納米顆粒相比，Hsp-Tat NP的粒徑稍大，推測較大粒徑可能與Hsp-Tat融合蛋白C末端引入較多的氨基酸有關.

圖2 Hsp-Tat蛋白納米籠粒徑的分布(A)和TEM照片(B)Fig.2 Size distribution (A) and TEM image (B) of Hsp-Tat protein nanocages

2.3 Hsp-Tat NP的生物相容性結果

用MTT法和活/死細胞染色法檢測Hsp-Tat NP在HEK-293T細胞的生物相容性，結果如圖3所示. 由圖3(A)可見，當Hsp-Tat NP蛋白質量濃度為100 μg/mL時，細胞生存率仍接近100%; 由圖3(B)可見，在納米粒蛋白質量濃度為100 μg/mL處理48 h后，僅檢測到極少數死細胞(紅色)，絕大多數細胞生長狀態良好(綠色)，表明Hsp-Tat NP具有良好的生物相容性.

圖3 Hsp-Tat NP的HEK-293T細胞生物相容性Fig.3 Biocompatibility of Hsp-Tat NP on HEK-293T cells

2.4 Hsp-Tat NP的siRNA復合特性結果

由于引入的Tat序列中含有豐富的精氨酸，因此推測Hsp-Tat NP可通過靜電吸附作用與負電荷核酸形成復合體結構. 通過凝膠阻滯實驗檢測Hsp-Tat NP的siRNA復合特性, 結果如圖4所示. 由圖4可見，隨著NP/siRNA 比例逐漸增加，siRNA在泳道中的遷移速度越來越慢，在比例為50時達到完全阻滯. 表明所有siRNA與帶正電荷的Hsp-Tat NP形成緊密的NP/siRNA復合物，徹底阻滯了siRNA在泳道中的遷移. 本文達到徹底阻滯效果的N/P比較高，這是由于Hsp-Tat融合蛋白中Hsp參與納米籠結構的組裝，其中正電荷氨基酸不能有效復合siRNA，融合蛋白中僅Tat序列中的正電荷氨基酸參與siRNA復合，導致凝膠阻滯N/P比較其他體系略高.

a～i: N/P=0,0.39,0.78,1.56,3.13,6.25,12.5,25,50.圖4 Hsp-Tat蛋白納米籠siRNA 復合后的凝膠阻滯實驗結果Fig.4 Experimental results of gel retardation of Hsp-Tat NP/siRNA complexes

2.5 Hsp-Tat NP/siRNA復合物的穩定性結果

通過粒徑變化檢測Hsp-Tat NP/siRNA復合物體外穩定性, 結果如圖5所示. 由圖5可見，7 d內Hsp-Tat NP/siRNA復合物在PBS中分散較好，復合物粒徑均未發生明顯變化(約55.1 nm)，表明蛋白納米粒與siRNA形成的復合體在體外具有良好的穩定性. Hsp-Tat NP/siRNA復合物粒徑較Hsp-Tat NP(40.2 nm)明顯增大，這是由于納米粒表面的正電荷氨基酸通過靜電吸附siRNA，使復合物粒徑增大所致.

圖5 Hsp-Tat NP/siRNA復合物的穩定性Fig.5 Stability of Hsp-Tat NP/siRNA complexes

2.6 Hsp-Tat NP的siRNA轉染

在Hsp-Tat NP與siRNA高效復合的基礎上研究其siRNA轉染能力. 為便于檢測和追蹤，用紅色熒光染料Cy3標記的siRNA(Cy3-siRNA)進行轉染實驗, 結果如圖6所示. 由圖6可見，在游離siRNA組(陰性對照)胞內未檢測到紅色熒光，在陽性脂質體組(陽性對照)和Hsp-Tat NP組細胞中均觀察到明顯的紅色熒光，紅色熒光廣泛分布在細胞質中，表明Cy3-siRNA被Hsp-Tat NP成功轉運至HEK-293T細胞的細胞質中.

圖6 Hsp-Tat NP 在HEK-293T細胞的siRNA轉染效果Fig.6 siRNA transfection effects of Hsp-Tat NP on HEK-293T cells

可見，本文制備的Hsp-Tat納米粒作為siRNA新型遞送載體，與已報道的其他Tat遞送系統相比具有如下優勢:

1) Tat序列用基因工程方法插入Hsp基因序列C末端，通過表達純化融合蛋白直接得到了自組裝Hsp-Tat納米粒，而不是將Tat肽通過繁瑣的化學方法修飾到納米顆粒上[26-31];

2) Hsp-Tat納米粒將Hsp納米籠極佳相容性和可降解性、 耐受惡劣環境等特性與Tat肽快速內吞或高效復合siRNA二者有機結合，構筑安全、 高效的新型siRNA納米遞送系統.

綜上所述，本文制備了基于Hsp-Tat納米粒的新型siRNA遞送體系，該納米粒具有良好的生物相容性及高效siRNA復合特性，可將siRNA高效遞送進入細胞內. Hsp-Tat納米粒作為一種安全高效的非病毒siRNA遞送載體，具有廣闊的應用前景.