高通量法測定血小板自身抗體的含量及臨床意義

趙贇霄，左 斌，阮長耿, 何 楊

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是一種以血小板減少為主要特征的出血性疾病。研究[1]表明，ITP患者體內可檢測出針對多種血小板膜糖蛋白(glycoprotein, GP)的自身抗體，主要包括抗GPⅡb/Ⅲa和Ⅰb/Ⅸ自身抗體[2-3]。自身抗體與血小板結合后通過其Fc段被肝脾網狀系統巨噬細胞識別吞噬，從而使血小板減少。有研究[4]表明不同自身抗體介導的血小板減少機制可能存在差異。抗GPⅠb自身抗體可通過Fc受體非依賴性機制使血小板減少。 因此，單一自身抗體的檢測已無法滿足ITP疾病的診斷和評估，需要同時鑒定多種自身抗體的特異性類型，以指導后續治療。流式免疫微球芯片技術(flow cytometricimmuno-bead array, FCIBA)以聚苯乙烯微球為載體，并用熒光加以區分同一體系中的不同微球，從而實現高通量檢測。

1 材料與方法

1.1 病例資料

1.1.1ITP組 選擇2016年11月15日—2017年11月10日在蘇州大學附屬第一醫院就診患者共661例，其中男性249例、女性412例，年齡15～86(48.12±15.32)歲，血小板計數為(5～96)×109/L。ITP診斷依據美國血液學協會指南[5]。另跟蹤調查地塞米松治療前后患者75例，口服地塞米松40 mg/d，服用4 d。

1.1.2非免疫性血小板減少組(Non-ITP) 選擇同期在蘇州大學附屬第一醫院血液科就診患者87例，其中男性39例、女性48例，年齡13～61(48.81±16.32)歲，血小板計數為(20～99)×109/L。包括再生障礙性貧血31例、急性淋巴細胞白血病18例、淋巴瘤17例、骨髓異常增生綜合征21例。

1.1.3正常對照組 選擇同期在蘇州大學附屬第一醫院體檢者158例，其中男性89例、女性69例，年齡21～57(33.41±9.93)歲，血小板計數為(121～287)×109/L。

1.2 方法

1.2.1外周靜脈血采集與處理 分別采集各組外周靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝；室溫下1 000 r/min離心5 min，吸取上層富血小板血漿(platelet rich plasma, PRP)至1.5 ml離心管；3 000 r/min離心5 min，棄去上清液；血小板沉淀加入1 ml含0.05%EDTA的0.01 mmol/L PBS(pH7.6)，吹打混勻，3 000 r/min離心5 min，棄上清液。如此將血小板洗滌3次后，棄上清液后，-80 ℃凍存備用。

1.2.2FCIBA檢測血小板特異性自身抗體 依據He et al[6]報道的方法。用鼠源性抗GPⅨ、抗GPⅠb、抗GPⅢa、抗GPⅡb和抗P-選擇素的單克隆抗體SZ1、SZ2、SZ21、SZ22和 SZ51(本研究所制備)，分別包被于自身帶有5種不同強度APC-cy7熒光的聚苯乙烯微球(美國Spherotech公司)。采用流式細胞儀分別檢測ITP組、Non-ITP組和正常對照組GPⅨ、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa和P-選擇素5種自身抗體，抗體水平以平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)表示。

1.2.3改良間單克隆抗體俘獲血小板抗原技術(monoclonal antibody immobilization of platelet antigens, MAIPA)檢測血小板特異性自身抗體 根據已報道的ELISA方法[7]分別檢測ITP組、Non-ITP組和正常對照組GPⅨ、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa和P-選擇素5種自身抗體。

1.3 統計學處理實驗數據采用SPSS 16.0統計軟件進行分析。樣本間MFI比較采用獨立樣本t檢驗，地塞米松治療前后抗體水平采用單因素方差分析。采用SPSS軟件繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線并計算曲線下面積(area under the curve，AUC)以評估FCIBA所檢測的血小板抗體水平對ITP的診斷效能。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微球穩定性測定于微球包被后的第1、5、10、20、60天測定微球的MFI值。SZ1、SZ2、SZ21、SZ22和SZ51 5種單克隆抗體的MFI。結果顯示包被微球在包被后第60天依然保持穩定。

2.2 批內、批間精密度評價

2.2.1批內精密度 通過對同一份陽性血漿重復檢測20次，5種單克隆抗體SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51的批內變異系數分別為8.35%、 5.65%、3.41%、3.63%和3.51%。

2.2.2批間精密度 通過對同一份陽性血漿連續檢測10 d，5種單克隆抗體SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51的批間變異系數分別為10.10%、9.13%、8.04%、9.59%和10.20%。

2.3 FCIBA方法學性能評價

2.3.1敏感度 FCIBA法分析ITP組661例樣本，其中抗GPⅨ陽性率為71.0%，抗GPⅠb陽性率為82.1%，抗GPⅢa陽性率為71.7%，抗GPⅡb陽性率為71.0%，抗P-選擇素陽性率為72.0%，5種抗體聯合檢測的陽性率為89.0%。FICBA和MAIPA敏感度差異無統計學意義。見表1。

2.3.2特異度 FCIBA法分析Non-ITP組和正常對照組245例樣本，其中抗GPⅨ陰性率為80.4%，抗GPⅠb陰性率為80.8%，抗GPⅢa陰性率為79.2%，抗GPⅡb陰性率為76.7%，抗P-選擇素陰性率為79.2%，5種抗體聯合檢測的陰性率為66.5%。FICBA和MAIPA特異度差異無統計學意義。見表1。

2.3.3精確度 FCIBA法分析總共906例樣本(3組共906例)，其中抗GPⅨ準確度為73.5%，抗GPⅠb準確度為81.8%，抗GPⅢa準確度為73.7%，抗GPⅡb準確度為72.5%，抗P-選擇素準確度為74.0%，5種抗體聯合檢測的準確度為82.9%。FICBA和MAIPA精確度差異無統計學意義。見表1。

2.3.4ITP組、Non-ITP組和正常對照組MFI 與Non-ITP組比較，ITP組抗GPⅨ(t=7.841，P<0.01)、抗GPⅠb(t=9.266，P<0.01)、抗GPⅢa(t=8.543，P<0.01)、抗GPⅡb(t=8.336，P<0.01)、抗 P-選擇素(t=8.841，P<0.01)5種抗體的MFI均高于Non-ITP組，差異有統計學意義。與正常對照組比較，ITP組抗GPⅨ(t=8.282，P<0.01)、抗GPⅠb(t=12.195，P<0.01)、抗GPⅢa(t=10.414，P<0.01)、抗GPⅡb(t=9.933，P<0.01)、抗P-選擇素(t=10.268，P<0.01)5種抗體的MFI均高于正常對照組，差異有統計學意義。與正常對照組比較，Non-ITP組5種抗體的MFI差異無統計學意義。見表2。

表1 FICBA和MAIPA敏感度、特異度和精確度的比較 [n(%)]

表2 ITP組、Non-ITP組和正常對照組

2.4 地塞米松治療前后ITP患者自身抗體的變化75例ITP患者經過口服地塞米松治療前后5種抗體的陽性率下降，治療后較治療前差異有統計學差異，抗GPⅨ(F=27.522，P<0.01)、抗GPⅠb(F=41.752，P<0.01)、抗GPⅢa(F=97.937，P<0.01)、抗GPⅡb(F=107.189，P<0.01)、抗P-選擇素(F=67.380，P<0.01)。詳見表3。

表3 地塞米松治療前后5種抗體的變化[N=75,n(%)]

2.5 ROC曲線利用SPSS軟件生成5種自身抗體的ROC曲線，見圖1。采用約登指數計算Cut-off值及最佳靈敏度和特異度。SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51共5種單克隆抗體的Cut-off值分別為9.385、20.605、17.770、17.385、15.985，對應的AUC分別為0.827[95%CI:0.797～0.856](P<0.01)、0.904[95%CI:0.883～0.925](P<0.01)、0.843[95%CI:0.813～0.873](P<0.01)、0.835[95%CI:0.805～0.865](P<0.01)、0.841[95%CI:0.812～0.871](P<0.01)。

3 討論

ITP是一種常見的出血性疾病，以血小板數量降低為主要表現，并且在ITP患者的外周血中經常可以檢測到抗血小板抗原的自身抗體[8]。通過利用流式細胞術建立一個新的檢測血小板膜糖蛋白特異性自身抗體的方法。該方法的基本原理是將5種不同的單克隆抗體包被在5種直徑為4 μm的聚苯乙烯微球上，而微球本身帶有不同熒光強度的APC-cy7，在同一反應體系中能夠被流式細胞儀區分，從而實現同一分標本可以同時檢測5項指標。

圖1 5種單克隆抗體診斷ITP的ROC曲線

在本研究中，FCIBA方法具有60 d的穩定性。并且該方法具有相對較小的批內、批間差異，SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51 5種單克隆抗體的批內差異分別為8.35%、5.65%、3.41%、3.63%和3.51%。批間差異分別為10.10%、9.13%、8.04%、9.59%和10.20%。與He et al[6]報道的方法數據基本一致。

分別采用FCIBA和MAIPA方法對ITP患者樣本中血小板自身抗體進行檢測，顯示FCIBA方法具有與MAIPA方法相當的敏感度，更高的特異度和準確度(表1)。臨床樣本檢測顯示ITP組相較于Non-ITP組和正常對照組差異均有統計學意義(P<0.01，表2)。同時跟蹤調查了75例口服地塞米松ITP患者治療前后5種自身抗體的變化情況。顯示地塞米松治療后自身抗體低于治療前(P<0.01，表3)，結果與文獻[9]報道一致。FCIBA法操作更簡單，耗時更少，效率更高，對患者血小板的需求量更少，具有更強的臨床適應性，同時也能對用藥后起到監測療效的作用。

根據ROC曲線所確定的Cut-off值，評估各自身抗體對ITP疾病的診斷效能。根據約登指數，FCIBA方法具有較高的敏感度、特異度。若聯合檢測5種自身抗體可大大提高檢測準確度。

該研究表明流式免疫微球技術直接檢測ITP患者血漿中的血小板自身抗體具有較高的敏感度、特異度和準確度，并且更高效便捷，能更好地適用于臨床檢測。