沉默CTHRC1調控p53介導的線粒體凋亡誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡

曾 健，蔣 斌，黃 果，陳 娟

乳腺癌是一種激素依賴性的高度異質性腫瘤，是女性癌癥相關死亡的主要原因[1]，其早期極易漏檢，而確診時往往已是晚期，同時高度異質性使其預后較差[2]。膠原三螺旋重復蛋白1(collagen triple helix repeat containing-1，CTHRC1)是一種抑制膠原蛋白表達和增加細胞遷移的分泌蛋白，可參與腫瘤病理進程。研究[3]顯示CTHRC1蛋白在乳腺癌組織高表達，并與乳腺癌不良預后相關；Lai et al[4]進一步表明CTHRC1可促進乳腺癌細胞增殖、侵襲與轉移，并抑制凋亡，但并未闡明其具體分子機制。p53是一種抑癌基因，通過調控細胞生長、凋亡和DNA損傷修復等過程抑制腫瘤進程[5]。研究[6]表明CTHRC1可負調控p53表達，促進肝癌的進程。然而，沉默CTHRC1表達是否可通過上調p53表達而激活線粒體凋亡途徑誘導乳腺癌細胞凋亡，目前尚未闡明。因此，該研究通過探討CTHRC1沉默是否通過激活p53介導的線粒體凋亡途徑誘導乳腺癌細胞凋亡，為臨床靶向治療乳腺癌提供更多理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器人乳腺癌MCF-7細胞株購自北京中國醫學科學院基礎醫學研究所；DMEM細胞培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；shRNA CTHRC1干擾質粒及其陰性對照質粒、siRNA p53干擾質粒及其陰性對照質粒均購自廣州銳博生物科技公司；LipofectamineTM3000試劑購自美國ThermoFisher公司；CTHRC1及GAPDH引物均由上海生工生物公司合成；RT-PCR試劑盒購自上海全式金公司；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、胞質和線粒體蛋白質提取試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10)購自北京索萊寶科技有限公司；CTHRC1抗體、PUMA抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、Apaf-1抗體均購自美國SANTA公司；caspase 3抗體、Cleaved- caspase 9抗體、Cytochrome C(Cyt C)抗體均購自美國CST公司；COX IV抗體購自美國Abbkine公司；GAPDH抗體購自英國Abcam公司；qPCR儀(VeritiTM96-well Thermal Cycler)購自美國ThermoFisher公司；酶標儀(Synergy H1 Hybriod Reader)購自美國BioTek公司；Western blot顯影儀購自上海天能生物公司；流式細胞儀(BD CALIBUR)購自美國BD公司。

1.2 細胞轉染取對數生長期人乳腺癌細胞MCF-7種于6孔板中，5×105個/孔，每孔加2 ml含10%牛血清DMEM培養基，置于37 ℃、CO2培養箱進行培養，待細胞貼壁后進行分組：blank組(不做任何處理)、sh-NC組(轉染shRNA CTHRC1陰性對照質粒pGPU6/GFP/Neo-NC)、sh-CTHRC1組(轉染shRNA CTHRC1干擾質粒pGPU6/GFP/Neo-CTHRC1)。當細胞融合度約達到80%時，按照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書進行轉染操作，將shRNA CTHRC1陰性對照質粒和shRNA CTHRC1干擾質粒分別轉染到MCF-7細胞中，轉染48 h后，收集細胞樣品檢測CTHRC1 mRNA和蛋白表達情況。CTHRC1 shRNA干擾序列：5′-ATCCCAAGTATAAT GGGAT-3′; 5′-ATCTGGAGAGATCCAATAT-3′。

1.3 Real-time PCR檢測收集各組細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，分光光度法測量總RNA含量及純度，并將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR擴增。引物序列：CTHRC1，F：5′-TCATCGCACTTCTTCTGTGGA- 3′，R：5′-GCCAACC CAGATAGCAACATC-3′；GAPDH，F：5′-AAGATCAT CAGCAATGCCTCC-3′，R：5′-TGGACTGTGGTCATGC CTT-3′。PCR反應條件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40個循環；94 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、15 min。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt方法計算CTHRC1相對表達量。

1.4 Western blot檢測蛋白表達收集各組細胞，采用RIPA裂解液裂解細胞，12 000 r/min離心25 min，取上清液得到總蛋白樣品，使用考馬斯亮(G250)檢測法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，接著轉到PVDF膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，洗滌后加入一抗CTHRC1(1 ∶200)、caspase 3(1 ∶1 000)、Cyt C(1 ∶1 000)、PUMA(1 ∶500)、Bax(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶500)、Apaf-1(1 ∶1 000)、Cleaved-caspase 9(1 ∶1 000)、COX IV(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日PBST緩沖液洗滌后，加入羊抗兔或鼠二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育30 min，洗滌后加入顯影液，采用Image-Pro Plus6.0軟件進行灰度分析，以目的蛋白條帶灰度值與對照組條帶灰度值的比值為相對表達量。

1.5 CCK-8檢測細胞活性取對數期各組MCF-7細胞種于96孔板，5 000個/孔，置于37 ℃、CO2培養箱分別培養12、24、48、72 h。每個培養時間點結束后每孔分別加入10 μl CCK-8，37 ℃繼續培養4 h，用酶標儀在450 nm下檢測吸光度(optical density, OD)值，最終以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡取對數生長期各組MCF-7細胞種于6孔板中，5×105個/孔，培養48 h后用胰酶輕柔消化得到單細胞，預冷PBS洗3次，加195 μl Annexin V-FITC結合液重懸浮細胞，再分別加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，25 ℃避光孵育20 min后，采用流式細胞儀進行檢測。

1.7 線粒體膜電位檢測取對數生長期各組MCF-7細胞種于6孔板中，5×105個/孔，培養48 h后用胰酶將細胞消化成單細胞，按照線粒體膜電位試劑盒說明書加入1 ml 1×JC-10染色工作液，細胞培養箱中37 ℃孵育20 min，用預冷的1×JC-10染色緩沖液洗滌2次，200 μl 1×JC-10染色緩沖液重懸浮細胞，采用流式細胞儀進行檢測。

1.8 線粒體和細胞質蛋白中Cyt C蛋白檢測收集對數期各組MCF-7細胞，預冷PBS(pH 7.4)洗滌細胞2次，按照胞質和線粒體蛋白質提取試劑盒說明書，利用胞質提取緩沖液和線粒體裂解緩沖液分別提取胞質蛋白和線粒體蛋白，按照上述1.4實驗步驟檢測Cyt C蛋白表達情況。

1.9 sh-CTHRC1和si-p53共干擾實驗將對數期MCF-7細胞種于6孔板，5×105個/孔，將細胞分組為NC組(轉染shRNA CTHRC1陰性對照質粒和siRNA p53陰性對照質粒)、sh-CTHRC1組(轉染shRNA CTHRC1干擾質粒)、si-p53組(轉染siRNA p53干擾質粒)、sh-CTHRC1+si-p53組(共轉染shRNA CTHRC1干擾質粒和siRNA p53干擾質粒)，采用LipofectamineTM3000將以上質粒轉染至MCF-7細胞中，細胞轉染48 h后收集細胞，按照上述1.6、1.4分別檢測線粒體和胞質蛋白中Cyt C以及凋亡通路相關蛋白表達水平。p53 siRNA干擾片段：5′-GAATGAGGC CTTAGAGTTA-3′。

1.10 統計學處理所有數據均采用SPSS 22.0統計軟件進行分析，本研究的連續數據以3個獨立實驗的表示。兩組比較采用t檢驗，單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTHCR1沉默對MCF-7細胞中CTHRC1 mRNA和蛋白表達的影響與blank組比較，sh-CTHRC1組細胞中CTHRC1 mRNA和蛋白表達水平均下降，差異有統計學意義(F=53.921、62.942，P<0.001)，而sh-NC組的CTHRC1 mRNA和蛋白表達水平無明顯差異，見圖1。表明成功干擾乳腺癌MCF-7細胞中CTHCR1表達。

圖1 CTHCR1沉默后MCF-7細胞中CTHRC1 mRNA和蛋白水平檢測

2.2 CTHRC1沉默對MCF-7細胞活性的影響CCK-8實驗結果顯示，與blank組比較，sh-CTHRC1組細胞在培養24、48、72 h時其增殖活性均被性抑制，差異有統計學意義(F=6.852、10.361、37.214，P<0.05)，見圖2。表明沉默CTHRC1可抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖。

2.3 CTHRC1沉默后對MCF-7細胞凋亡的影響流式細胞術檢測結果(圖3A)顯示，與blank組比較，sh-CTHRC1組細胞凋亡率性升高，差異有統計學意義(F=73.254，P<0.001)，sh-NC組細胞凋亡發生率無差異性，；Western blot實驗結果(圖3B)顯示，與blank組比較，sh-CTHRC1組細胞中Cleaved-caspase3表達量升高，差異有統計學意義(F=53.921，P<0.001)，sh-NC組細胞中Cleaved-caspase3表達無差異性。表明沉默CTHRC1可促進MCF-7細胞凋亡。

圖2 CCK-8實驗檢測各實驗組細胞活性

2.4 CTHRC1沉默后對MCF-7線粒體膜電位及Cyt C蛋白胞內定位影響線粒體膜電位檢測結果(圖4A)顯示，與blank組比較，sh-NC組細胞線粒體膜電位無變化，sh-CTHRC1組細胞線粒體膜電位下降，差異有統計學意義(F=49.911，P<0.001)。Western blot結果(圖4B)顯示，與blank組比較，sh-CTHRC1組細胞線粒體中Cyt C蛋白表達降低，差異有統計學意義(F=197.014，P<0.001)，而胞質中Cyt C蛋白表達升高，差異有統計學意義(F=123.412，P<0.001)。表明CTHRC1沉默可導致MCF-7細胞線粒體損傷并可能誘發線粒體介導的細胞凋亡途徑。

2.5 CTHRC1沉默后對p53介導的線粒體凋亡途徑相關蛋白表達影響與blank組比較，sh-CTHRC1組中p53蛋白表達升高，差異有統計學意義(F=60.714，P<0.001)，p53介導的線粒體凋亡途徑相關蛋白Apaf-1、Cleaved-caspase 9表達上升，差異有統計學意義(F=42.331、57.683，P<0.001)，抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達下降，差異有統計學意義(F=23.214，P<0.001)，而促凋亡因子Bax和PUMA蛋白表達上升，差異有統計學意義(F=44.075、35.237，P<0.001)，而sh-NC組細胞中Apaf-1、Cleaved-caspase9、Bcl-2、Bax和PUMA蛋白表達水平無差異變化。提示CTHRC1沉默可能通過p53介導的線粒體途徑凋亡誘導MCF-7細胞凋亡。見圖5。

2.6 CTHRC1和p53共干擾后對MCF-7細胞凋亡的影響與NC組比較，si-p53組細胞p53蛋白水平下調(t=40.401，P<0.001)，表明p53干擾成功(圖6A)。細胞凋亡檢測結果(圖6B)顯示，與NC組比較，si-p53組細胞凋亡率無差異(t=0.281，P>0.05)，而sh-CTHRC1組細胞凋亡率增加(t=38.852，P<0.001)；與sh-CTHRC1組比較，sh-CTHRC1+si-p53組細胞凋亡率又降低(t=13.990，P<0.01)，說明CTHRC1沉默誘導的MCF-7細胞凋亡依賴于p53蛋白。Western blot結果(圖6C)顯示，與sh-CTHRC1組比較，sh-CTHRC1+si-p53組細胞線粒體中Cyt C蛋白表達升高(t=21.723，P<0.01)，而細胞質Cyt C蛋白表達降低(t=65.129，P<0.01)。進一步表明CTHRC1沉默可激活p53介導的線粒體細胞凋亡途徑進而誘導MCF-7細胞凋亡。

圖3 CTHRC1沉默檢測MCF-7凋亡率和凋亡相關蛋白表達

圖4 CTHRC1沉默后檢測MCF-7細胞線粒體膜電位和Cyt C蛋白表達

圖5 CTHRC1沉默后檢測p53介導的線粒體凋亡途徑相關蛋白表達

圖6 共干擾CTHRC1和p53后檢測細胞凋亡率和Cyt C蛋白胞內定位

3 討論

盡管醫療水平提高，乳腺癌早期臨床檢測和治療策略有所改善，但乳腺癌患者的預后仍較差[7]，CTHRC1作為一種新的致癌基因，已被證實在乳腺癌中異常高表達[3]。Lai et al[4]利用薈萃分析310例乳腺癌患者進行CTHRC1的預后價值評估，發現CTHRC1與較差生存率密切相關，可以作為乳腺癌新的獨立預后生物標志物。因此，可以探究CTHRC1在乳腺癌發生過程中的作用機制，為臨床靶向治療提供理論依據。本研究選用CTHRC1高表達乳腺癌細胞MCF-7，研究沉默CTHRC1表達對MCF-7細胞凋亡影響以及內在分子機制。當沉默MCF-7細胞中CTHRC1表達，細胞增殖活性抑制，提示CTHRC1沉默可能與抑制乳腺癌細胞生長有關聯。

凋亡是一個細胞程序性停止生長和分裂的過程，特征是發生眾多與酶相關的生化反應以及細胞結構發生特征性的形態學改變，結果是清除機體有害細胞，且對周圍組織損傷最小[8]，細胞凋亡調控失敗，體內受損細胞累積，容易導致癌癥發生。細胞凋亡的啟動依賴于一系列的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的激活，這些蛋白酶被稱為caspases，分為兩類，起始凋亡蛋白酶和執行凋亡蛋白酶[9]，凋亡機制一旦檢測到細胞損傷，起始凋亡蛋白酶如caspase 9會從非活性狀態下即前體-凋亡蛋白酶被激活，進而對執行凋亡蛋白酶前體如Pro-caspase 3進行切割，產生有活性的執行蛋白酶如Cleaved-caspase 3，激活內切酶導致DNA片段化和細胞骨架破壞等一系列引起細胞凋亡事件。在MCF-7細胞中沉默CTHRC1表達，細胞凋亡水平升高，進一步檢測相關蛋白顯示，Cleaved-caspase 9表達升高，caspase 3發生切割現象，說明CTHRC1的沉默可以引起起始凋亡蛋白caspase 9活化，進而活化caspase 3蛋白誘導凋亡發生。執行凋亡蛋白酶caspase 9參與哺乳動物細胞中線粒體起始的內源凋亡途徑，這種形式的凋亡依賴于線粒體釋放的凋亡因子其中最主要的是細胞色素C(Cyt C)[10]，當細胞受凋亡信號刺激時，Bcl-2家族蛋白中的促凋亡因子Bax從細胞質轉移到線粒體外膜，與膜上的電壓依賴性陰離子通道相互作用，線粒體膜電位下降，膜通透轉變孔(MPTP)打開促進線粒體釋放Cyt C到細胞質基質中，而Bcl-2家族蛋白中的抑凋亡因子Bcl-2抑制Bax功能阻止線粒體通膜道開啟[11]，Cyt C被釋放到細胞質中，會與凋亡因子Apaf-1結合，其N端的caspase招募結構域招募caspase 9，并促進其自身切割活化[12]。本實驗結果顯示，CTHRC1沉默后Bax蛋白表達升高，線粒體膜電位下降，Cyt C蛋白從線粒體高表達轉移到細胞質基質中高表達，Apaf-1蛋白表達也升高，進一步說明CTHRC1沉默誘導MCF-7凋亡是依賴于線粒體起始的內源凋亡途徑。

p53基因是關鍵的腫瘤抑癌基因， p53蛋白控制著機體重要的細胞進程，如DNA修復、凋亡、代謝、發育和炎癥等[13]。P53蛋白作為轉錄激活因子可以促進其下游基因PUMA、Bax表達。本研究結果顯示在MCF-7細胞中，CTHRC1沉默后PUMA蛋白和Bax蛋白表達均升高。細胞應激引起凋亡時，一方面p53直接與促凋亡因子Bax結合，誘導線粒體外膜通透性改變；另一方面PUMA抑制抗凋亡因子BCL-xL與p53蛋白結合，促進自由的 p53蛋白與Bax結合誘導線粒體介導的凋亡[14]。有研究[6,15]報道，在肝癌細胞中被乙肝病毒(HBV)激活的CTHRC1通過抑制p53蛋白促進癌細胞增殖。實驗結果顯示，CTHRC1沉默后，p53蛋白表達升高，說明CTHCR1在MCF-7細胞中發生了依賴于p53介導的線粒體凋亡。進一步實驗表明，當CTHRC1和p53蛋白共干擾后，MCF-7細胞凋亡發生被逆轉，Cyt C蛋白在線粒體中表達升高，說明p53的干擾阻止了線粒體外膜變化，抑制了凋亡的發生。

綜上，本研究確定了shRNA沉默CTHRC1可以激活p53介導的線粒體凋亡，抑制乳腺癌細胞生長。然而，作為致癌基因CTHRC1如何調控p53基因轉錄表達目前還不知曉，本研究下一步將重點研究CTHRC1調控p53表達的機制，以期為解決乳腺癌預后性差提供新的靶點和解決方案。