淫羊藿苷對肺纖維化大鼠模型的影響及其機制

安云霞,張曉菊,汪 錚,張群成,周英欣,李曉亮

2020-06-11接收

基金項目：河南省科技廳基礎與前沿項目(編號：142300410383)；河南省醫學科技攻關計劃省部共建項目(編號：SB201902028)

作者單位：河南省人民醫院呼吸與危癥學科、鄭州大學人民醫院、河南大學人民醫院，鄭州 450000

作者簡介：安云霞，女，碩士研究生,主治醫師，責任作者，E-mail：23706216@qq.com

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是由多種因素引起的慢性、進行性和纖維化性的不可逆轉型肺間質疾病，預后差、病死率高，發病率呈上升趨勢[1]。以彌漫性間質炎癥、細胞外基質(extracellular matrix, ECM)過度沉積和呼吸功能障礙為特征。但發病機制尚不清楚，目前認為主要與成纖維細胞向肌纖維細胞分化有關，后者分泌過量的ECM分子，最終導致肺結構的廣泛破壞和重塑[2]。目前IPF指南僅推薦吡非尼酮和尼達尼布在臨床上使用，兩者均具有抗纖維化和抗炎癥的作用，但因效果欠佳和昂貴的價格導致其應用受限[3]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分之一，對多種癌細胞表現出抗腫瘤作用[4]。但淫羊藿苷能否對IPF存在潛在的治療作用還需驗證。該文研究淫羊藿苷對肺纖維化模型大鼠病理損傷和炎癥反應的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑雄性SD大鼠60只，清潔級8～10周齡，體質量250～300 g，購自北京維通利華公司，飼養溫度26～28℃，濕度60%～80%，自由采食和飲水；博來霉素(bleomycin，BLM)A5購自天津太和制藥有限公司；淫羊藿苷(純度≥98%)購自中國國家藥物和生物制品鑒定研究所；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自美國Sigma公司；HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒購自南京凱基生物有限公司；化學發光液、PVDF膜購自美國Invitrogen公司；抗體均購自美國Abcam公司；ELISA試劑盒均購自美國RD公司；甲醛購自南京化學有限公司；切片機購自德國Leica公司。

1.2 主要儀器化學凝膠成像系統購自上海天能有限公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；多功能酶標儀購自瑞士TECAN公司；超低溫冰箱購自美國THERMO公司；電子天平購自上海天平儀器廠；PCR儀、電泳儀及半干轉膜儀均購自美國伯樂公司；Gel View 6000化學發光凝膠成像系統購自廣州云星儀器有限公司；切片機購自德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1肺纖維化大鼠模型的建立 大鼠適應性飼養1周，采用BLM誘導大鼠肺纖維化模型[5]。即氣管內給予模型組和模型加藥組大鼠0.2 ml的5 mg/kg BLM(采用生理鹽水溶解)，連續給藥28 d，非模型動物以相同給藥方式給予0.2 ml生理鹽水。

1.3.2實驗分組與給藥 選取上述模型大鼠40只大鼠隨機分為4組，模型組(BLM組)和模型加藥組：BLM+淫羊藿苷(20 mg) 組(BI20組)、BLM+淫羊藿苷(40 mg) 組(BI40組)和BLM+淫羊藿苷(80 mg)組(BI80組)；另選取上述健康大鼠10只組成健康組(HC組)。3個模型加藥組分別腹腔給予對應濃度的淫羊藿苷藥液，每天給藥1次，連續給藥4周；HC組和BLM組均腹腔給予等量基質液。

1.3.3HE、TUNEL和Masson染色 取左肺用生理鹽水充分沖洗，再用10 %中性福爾馬林固定，經脫水、透明、浸蠟和包埋，最后切片。后行HE、TUNEL和Masson染色。在光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.3.4Western blot 在冰上用含蛋白抑制劑的裂解液從右肺組織樣本中裂解提取總蛋白，將裂解液12 000 r/min離心10 min，上清液100℃下變性10 min。用BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。取適量蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜上，再用5 %的脫脂牛奶封閉1 h后加入Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、纖維化標記分子轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和VEGFR一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日再加入辣根過氧化物酶標記的相對應的二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h。最后滴加ECL溶液曝光。以GAPDH為內參。

1.3.5ELISA檢測 股動脈采血，自然凝固后，于4 ℃、3 000 r/min條件下離心，收集血清分裝保存。嚴格按試劑盒說明書測定白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-10的含量。

2 結果

2.1 淫羊藿苷對肺纖維化大鼠組織病理學改變的影響HE染色和TUNEL染色檢測肺纖維化大鼠組織病理學改變，結果如圖1所示，HC組大鼠肺部組織結構完整，未見炎性細胞浸潤或間質增厚現象；而與HC組相比，BLM組則表現出顯著的組織病理學改變，包括肺泡腔塌陷、間質明顯增厚、炎性細胞浸潤和成纖維細胞間質浸潤等，細胞凋亡率也顯著上升(F=18.663，P<0.01)；同時，與BLM組相比，3個模型加藥組大鼠的肺部組織病理學改變得到了淫羊藿苷劑量依賴性的改善，細胞凋亡率也對淫羊藿苷濃度增大而明顯降低(F=10.254，P<0.01)。

2.2 淫羊藿苷對肺纖維化大鼠凋亡相關蛋白表達的影響Western blot檢測各組大鼠凋亡相關蛋白表達情況，結果如圖2所示，與HC組相比，BLM組大鼠肺組織中促凋亡蛋白Bax表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達減少，同時Bcl-2/Bax比值也顯著降低(F=45.631，P<0.01)；而經淫羊藿苷處理后，與BLM組相比，3個模型加藥組大鼠肺組織中Bax表達逐漸減少，Bcl-2表達逐漸增加，與此同時，Bcl-2/Bax比值也隨淫羊藿苷濃度的增大而增加(F=26.153，P<0.01)。另外，Caspase-3、Caspase-9表達情況如圖2所示，與HC組相比，BLM組大鼠肺組織中凋亡執行蛋白Caspase-3、Caspase-9表達明顯增加(F=12.451、11.521，P<0.01)；而經淫羊藿苷處理后，與BLM組相比，各模型加藥組Caspase-3、Caspase-9表達水平隨淫羊藿苷濃度的增加而下調(F=8.157、6.568，P<0.01)。

圖1 大鼠肺組織HE染色和TUNEL染色 ×200

圖2 淫羊藿苷對肺纖維化大鼠凋亡相關蛋白表達的影響

2.3 淫羊藿苷對肺纖維化大鼠炎癥反應的影響ELISA方法檢測淫羊藿苷對各組大鼠血清中炎癥因子表達的影響。結果如圖3所示，與HC組相比，BLM組大鼠血清中促炎因子IL-6和TNF-α的表達量明顯上調，抗炎因子IL-10表達量明顯下調(F=25.124、37.224、5.124，P<0.01)；而經淫羊藿苷治療后，與BLM組相比，BI20、BI40、BI80組促炎因子IL-6和TNF-α明顯下調(P<0.01)，抗炎因子IL-10明顯上調(F=16.465、19.267、3.375，P<0.01)，且與淫羊藿苷濃度呈正比。

圖3 淫羊藿苷對肺纖維化大鼠炎癥反應的影響

2.4 淫羊藿苷對肺纖維化大鼠膠原纖維沉積的影響Masson染色檢測各組大鼠肺纖維化情況，結果如圖4A所示，HC組大鼠肺泡結構正常，未見明顯病理變化；BLM組大鼠肺泡結構破壞嚴重，肺泡腔基本消失，藍色膠原纖維呈彌漫性增生沉積；而淫羊藿苷3個治療組大鼠仍有肺泡結構，膠原纖維沉積較BLM組均明顯減輕，且與淫羊藿苷濃度存在對應關系。另外，Western blot檢測分組大鼠肺組織中TGF-β1和α-SMA表達水平，結果如圖4B所示，與HC組相比，BLM組大鼠肺組織中TGF-β1和α-SMA的表達均顯著上調(F=32.466、15.428，P<0.01)，淫羊藿苷3個治療組大鼠肺組織中TGF-β1和α-SMA的表達水平顯著下調(F=18.159、11.217，P<0.01)。

圖4 淫羊藿苷對肺纖維化大鼠膠原纖維沉積的影響

2.5 淫羊藿苷對肺纖維化大鼠bFGF、VEGF和VEGFR表達的影響Western blot 檢測各組大鼠肺組織中bFGF、VEGF和VEGFR的表達水平，結果如圖5所示，與HC組相比，BLM組大鼠肺組織中3者的表達均顯著上調(F=26.568、32.482、59.274，P<0.01)，而給予淫羊藿苷后，各模型加藥組大鼠肺組織中3者的表達水平受到淫羊藿苷劑量依賴性的下調(F=12.251、16.392、23.528，P<0.01)。

圖5 淫羊藿苷對肺纖維化大鼠bFGF、VEGF和VEGFR表達的影響

3 討論

BLM是一種強效致纖維化的抗腫瘤藥物，被廣泛應用于建立IPF動物模型[6]。近年來，中藥越來越受到醫學界的重視，很多中草藥均被開發運用與臨床治療/輔助治療，然而具有多種生物學功能的淫羊藿苷能否成為治療IPF的潛在藥物還有待研究。

IPF的發生必定伴隨著肺組織完整性、細胞及細胞間質等肺部病理學改變。損傷的上皮細胞能吸引聚集纖維細胞，在肺泡上皮細胞凋亡和纖維細胞過度增殖的共同作用下實現肺纖維化形成[7]。研究[8-9]表明，誘導機體產生抗氧化酶、清除自由基、調節細胞凋亡和自噬途徑、抑制肺成纖維細胞增殖、促進其凋亡均能減少模型動物肺纖維化。本研究也得出類似結果，淫羊藿苷能抑制肺泡上皮細胞發生凋亡，從而改善BLM誘導的肺纖維化大鼠肺組織病理學改變。

肺泡上皮細胞反復微損傷異常激活機體免疫細胞，分泌各種細胞因子和趨化因子促使間質細胞的增殖，是IPF發生發展公認的過程。其中，炎癥因子在該過程中起到很關鍵的作用。研究[10-11]顯示，在肺纖維化動物模型體內TNF-α表達明顯增加，下調TNF-α和可溶性受體的表達能有效抑制炎癥和纖維化，阻斷IL-6傳導通路可以延緩肺纖維化的進程[12]。如桃葉珊瑚苷能降低BLM誘導的肺纖維化小鼠肺組織炎癥因子表達水平，從而減輕小鼠肺纖維化程度[7]。本研究也證明，淫羊藿苷改善BLM誘導的肺纖維化進程與降低大鼠體內炎癥因子水平有關。

IPF的致病途徑被認為是由TGF-β1等促纖維化介質誘導的肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的非控制性分化，同時過多的ECM沉積在間質空間導致實質結構和肺功能的喪失。因此，抑制肺成纖維細胞異常分化可能對IPF產生潛在的治療作用。研究[1，6，13-14]表明，冬凌草甲素和桃葉珊瑚苷抑制纖維化標記分子α-SMA、TGF-β1和Collagen Ι等的表達水平，即通過調節TGF-β1/Smad途徑抑制肌成纖維細胞分化和BLM誘導的肺纖維化發生。本研究顯示，淫羊藿苷能抑制BLM誘導的肺纖維化大鼠α-SMA、TGF-β1的表示水平，進而減少膠原纖維的大量沉積，從而延緩大鼠肺纖維化進程。

IPF發生過程中，肺部纖維化是其最終的形態歸宿。成纖維細胞生長因子(FGF)是一個同源性多肽家族，參與調節細胞的增殖和分化，bFGF與肺纖維化關系密切。機體在病理狀態下，bFGF/VEGF/VEGFR通路被激活，促進血管內皮細胞增殖、分化，增加血管通透性，從而刺激肺纖維化血管新生。研究[15]表明，抑制bFGF的表達能使膠原和彈力纖維的合成減少，減慢肺纖維化的發展進程，即阻斷bFGF通路可以緩解肺纖維化程度。本研究得出，淫羊藿苷有效抑制bFGF/VEGF/VEGFR通路表達，這可能與減緩BLM誘導的肺纖維化大鼠肺纖維化發展進程有關，但淫羊藿苷對肺纖維化的調節作用是否存在其他信號通路的參與還有待進一步深入研究。

綜上所述，淫羊藿苷能改善模型大鼠肺部組織結構完整性，降低肺泡細胞凋亡率；上調Bcl-2/Bax比值，下調Caspase-3、Caspase-9蛋白表達；上調表達促炎因子IL-6、TNF-α，下調抗炎因子表達IL-10；抑制膠原纖維沉積；抑制bFGF、VEGF和VEGFR高表達。淫羊藿苷能改善BLM誘導的肺纖維化大鼠肺組織病理損傷，減輕肺部炎癥反應，其機制與抑制bFGF/VEGE/VEGFR通路激活有關。