清腦益元湯對大鼠腦缺血損傷Nestin、NGF表達的影響

俞睿 祝美珍 劉倩菁 向昱臻 蘇萍 韋亮 孫詩杰

(廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200)

缺血性腦血管疾病作為臨床常見病和多發病，其發病年齡逐漸呈現年輕化趨勢，已成為威脅人類健康與生命的重要疾病之一。目前臨床上主要采用溶栓、降纖和神經保護等治療手段，但受制于其嚴格的時間窗和適應、禁忌證要求，預后效果并不理想。如何有效提高缺血性腦血管疾病治療效果、改善患者遺留的后遺癥是醫學界長期研究的重點和熱點。近年來研究發現，腦缺血損傷可誘導內源性神經干細胞的增殖，巢蛋白 (Nestin) 作為神經干細胞(NSC)的標記物，已廣泛應用于NSC的鑒定，其在腦組織損傷中的表達規律與NSC增殖及凋亡存在密切關聯性〔1〕。而神經生長因子(NGF) 作為神經營養因子家族(NTF) 中重要的細胞因子，在腦缺血損傷后，對神經元起到修復作用，可改善神經元的病理狀態。已有研究證實〔2，3〕，通過增加腦缺血損傷中的Nestin、NGF蛋白表達水平，能有效可促進神經元的再生，抑制神經細胞凋亡。近年來由于中藥復方多靶點、多途徑的優勢與特點在預防和治療缺血性腦血管疾病方面取得了顯著成效。根據“祛瘀生新，精成髓生”理論而譴藥組方的清腦益元湯，經前期臨床和實驗研究發現有較好的治療效果。因此，本研究基于前期研究基礎上通過觀察清腦益元湯對腦缺血損傷性大鼠Nestin、NGF表達水平的影響，試圖進一步探明清腦益元湯防治缺血性腦血管病的作用機制，為清腦益元湯防治腦缺血損傷提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年健康SPF級雄性SD大鼠192只，體重(250±50)g，均購自廣西醫科大學動物實驗中心(實驗動物生產許可證號：SCXK桂2014-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK桂2014-0003)。飼養于廣西中醫藥大學動物實驗中心，常規自由飲食飲水飼養。

1.2實驗藥物 清腦益元湯：水牛角30 g、水蛭8 g、肉蓯蓉10 g、赤芍15 g、參三七10 g、川牛膝15 g、紫河車15 g、紅景天20 g、干地黃10 g、制首烏10 g，以上所用藥材均由廣西中醫藥大學第一附屬醫院購入。

1.3實驗設備與試劑 手動輪轉石蠟切片機(德國Leica公司)、-80℃超低溫冰箱(海爾公司)、蔡司顯微鏡(德國Zeiss公司)、高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)、全自動實時熒光定量PCR儀(LightCycler96)、Nestin單克隆抗體(英國abcam公司，生產批號：GR3234309-2)、NGF單克隆抗體(英國abcam公司，生產批號：GR226375-44)、反轉錄試劑盒(北京天根生物科技有限公司，生產批號：R6424)、擴增試劑盒(北京天根生物科技有限公司，生產批號：R6306)、Nestin、NGF引物及內參 (上海生工股份有限公司提供) 。

1.4方法

1.4.1動物分組 將192只成年健康雄性SD大鼠按體重依次編號，用隨機數字表將大鼠分為兩大組，每大組再分為四小組即空白組(6只)、假手術組(30只)、模型組(30只)、清腦益元組(30只)。除空白組外，假手術組、模型組和清腦益元湯組分別按術后取材時間點分為1 d、3 d、7 d、14 d、28 d 5個亞組，5個亞組每組6只。

1.4.2動物造模 適應性喂養1 w后進行實驗，空白組正常喂養，假手術組線栓插入大鼠右側頸總動脈(0.8±0.2)cm，此深度不足以阻斷大腦中動脈血流，模型組及清腦益元湯組參考Longa等〔4〕法制備大鼠大腦中動脈梗死模型(MCAO)，制成大鼠急性腦缺血損傷模型。

1.4.3給藥 參照賀氏劑量-體表面積換算法〔5〕，以體重60 kg成人每天服用清腦益元湯，參考文獻〔6〕中的標準方程進行換算，按體量14 ml/kg進行灌胃，為達到血藥濃度，預灌藥7 d，分別于每日上午9∶00～10∶00及下午16∶00～17∶00時進行灌胃，空白組、假手術組、模型組予蒸餾水灌胃，清腦益元組予清腦益元湯灌胃，藥物濃度含生藥材2 g/ml，直至按各時間點取材。

1.5標本采集及處理 用10%水合氯醛按35 mg/kg經腹腔注射麻醉鼠后，固定大鼠，用組織剪在大鼠胸骨下沿雙側肋骨走行方向打開胸腔，充分暴露心臟、肝臟，剪開右心耳，同時用穿刺針小心插入大鼠左心尖部并用止血鉗固定，快速注入0.9%氯化鈉約200 ml，灌注至大鼠全身血色變淺、變白、四肢抽搐，接著灌注4%的多聚甲醛300 ml，見肺臟、肝臟變蒼白色，全身變僵硬，提示灌注成功。灌注完成后，用組織剪從頸部剪開皮膚后，用止血鉗尖從腦囟門后輕微插入，咬去顱骨，充分暴露大腦后，用鑷子的尾部剝取出大腦，分別放入液氮罐中(Real-Time PCR)和組織固定液中(免疫組化)。

1.6指標檢測

1.6.1采用免疫組化法檢測大鼠腦缺血側皮質區Nestin、NGF表達 嚴格按照通用二步法試劑盒操作，用顯微鏡10×視野進行觀察整體陽性表達情況，再取40×視野進行拍照。運用Image圖像分析軟件對缺血側皮質區Nestin、NGF陽性細胞進行統計，取其平均值。

1.6.2采用Real-Time PCR法檢測大鼠腦缺血側皮質區Nestin、NGFmRNA的表達 提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA作為模板進行PCR擴增，擴增條件：預變性95℃、15 min；采用二步法進行擴增，變性95℃、10 s；退火/延伸60℃、32 s；共進行40個循環；選擇SYBR GreenⅠ法，點擊開始反應，結束后得到擴增曲線、溶解曲線和Ct值。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.7統計學方法 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1清腦益元湯對大鼠腦缺血側皮質區Nestin表達的影響 Nestin在大鼠腦組織缺血側皮質區陽性反應物主要位于胞質，呈棕黃色或深棕褐色。空白組、假手術組可見少量Nestin陽性細胞的表達，兩組在各時間點比較差異均無統計學意義(P>0.05)。在相同時間點與假手術組比較，模型組、清腦益元組Nestin的陽性細胞明顯升高(P<0.01)；模型組、清腦益元組Nestin陽性細胞在缺血1 d表達開始升高，3 d后達高峰，且隨腦缺血損傷時間延長其表達逐漸下降；與模型組在同一時間點相比，清腦益元組Nestin陽性細胞表達明顯升高(P<0.01)。見表2，圖1。

2.2清腦益元湯對大鼠腦缺血側皮質區NGF表達的影響 NGF在大鼠腦組織缺血側皮質區免疫陽性反應物主要位于胞質和突起內，呈棕黃色顆粒。在相同時間點各組間比較，與空白組比較，假手術組NGF陽性細胞表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；與假手術組相比，模型組、清腦益元湯組NGF陽性細胞表達升高有顯著差異(P<0.01)；模型組、清腦益元湯組NGF陽性細胞在缺血1、3 d開始增強，7 d達到最高峰，14 d后呈逐步降低的趨勢；與模型組相比，清腦益元湯組NGF陽性細胞表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表3。

2.3Real-Time PCR檢測大鼠腦缺血側皮質區Nestin mRNA的表達 在相同時間點內，與空白組相比，假手術組大鼠腦組織缺血側皮質區Nestin mRNA的表達量無顯著差異(P>0.05)；與假手術組相比，模型組、清腦益元湯組Nestin mRNA表達量顯著增加(P<0.01)；模型組、清腦益元組Nestin mRNA表達在缺血1 d表達開始升高，3 d后達高峰，且隨腦缺血損傷時間延長其表達逐漸下降；與模型組相比，清腦益元湯組Nestin mRNA表達量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表2 各時間點Nestin陽性細胞的表達個/視野)

圖1 各組缺血不同時間點Nestin陽性細胞表達結果(×40)

圖2 各組缺血不同時間點NGF陽性細胞表達(×40)

表3 缺血各時間點NGF陽性細胞的表達個/視野)

表4 缺血各時間大鼠缺血側皮質區Nestin mRNA的表達

2.4Real-Time PCR檢測大鼠腦缺血側皮質區NGF mRNA的表達 在相同時間點內，與空白組相比，假手術組大鼠腦組織缺血側皮質區NGF mRNA的表達量無差異(P>0.05)；與假手術組相比，模型組、清腦益元湯組NGF mRNA表達量顯著增加(P<0.01)；模型組、清腦益元湯組NGF陽性細胞在缺血1、3 d開始增強，7 d達到最高峰，14 d后呈逐步降低的趨勢；與模型組相比，清腦益元湯組NGF mRNA表達量升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 缺血各時點大鼠缺血側皮質區NGF mRNA的表達

3 討 論

3.1腦缺血損傷與Nestin及NGF的關系 Nestin是一種在胚胎NSC呈一過性表達的中間絲蛋白，具有維持神經前體細胞正常形態的功能，隨著分化、增殖和遷移的神經細胞不斷發育成熟，Nestin表達強度會逐漸減弱甚至消失，并逐漸被其他中間絲蛋白所代替。Nestin主要存在于胚胎發生期的中樞神經系統中，被認為是神經前體細胞或NSC的特異性標記物之一〔7〕。近年來研究發現，在腦缺血損傷早期可誘導Nestin的表達，而在腦缺血損傷最嚴重的區域表達最為明顯。Nestin作為NSC的特異性標記蛋白，可誘導內源性NSC的增殖，并實現自我更新，在腦缺血損傷后，Nestin在對受損的腦組織結構進行修復和重塑以及在腦損傷區域高表達都預示了Nestin的激活。郭云良等〔8〕研究發現，在腦缺血灌注損傷后，Nestin在皮質區和紋狀體區在1 d、7 d出現高表達，隨后逐漸降低，結果提示Nestin具有促進NSC增殖的作用，并參與了損傷后腦組織的修復過程。NGF作為NTF之一，對神經元的增殖、分化、存活和功能維持起到調控作用〔9〕，在病理情況下，NGF可以促進腦缺血后NSC增殖，抑制神經元發生凋亡，從而對受損的神經元起到全面而持久的保護作用。王亞軍等〔10〕通過子午流注針法對腦缺血動物模型進行干預研究發現，在腦缺血損傷后，針刺組NGF在6 h開始增高，7 d時達到最高峰，14 d后逐漸下降，但21 d時仍高于模型組，結果表明針刺可以上調腦內神經因子NGF表達，改善神經元細胞生存的微環境，促進腦缺血后NSC的增殖，減輕腦損傷，從而發揮腦保護作用。

3.2清腦益元湯對腦缺損傷Nestin及NGF的影響 缺血性腦卒中多好發于中老年人，中醫認為缺血性腦卒中是各種致病因素相互作用，阻塞脈絡，填塞清竅所致，其總的病機是本虛標實。“瘀、熱、毒、髓”是缺血性腦卒中的重要病機，因而在對缺血性腦卒中的治療上，要從“血瘀→瘀熱→瘀毒→髓傷”這一整體病機關聯著手，深入探索清腦益元湯阻斷腦缺血損傷“缺血-炎癥-水腫-凋亡”的連鎖效應〔11〕，在清熱祛瘀的同時，要補腎益元生髓，標本兼治改善腦內環境。前期我們研究發現〔12〕，清腦益元湯能夠有效抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-8陽性細胞的過度表達，阻斷腦缺血損傷的炎癥連鎖反應，使腦脈通暢而達到防治效果。此外，臨床結果表明〔13〕，清腦益元湯能減輕缺血性腦卒中患者急性期神經功能缺損程度，提高臨床療效。清腦益元湯是立足于缺血性腦卒中病因病機的基本特點，深入剖析“腎”“腦”之間的關聯性，根據“祛瘀生新，精成髓生”理論，扶正祛邪的治療法則而立法處方，同時又充分體現了中醫 “病在上者下取之”的整體思想。

本實驗研究結果表明，清腦益元湯可能通過上調腦內神經元Nestin、NGF蛋白及mRNA表達水平，從而參與腦缺血的內源性保護機制，促進神經細胞增殖，減輕腦缺血損傷，從而發揮腦保護作用，與相關報道研究一致〔14，15〕。推測清腦益元湯在發揮腦保護的作用機制主要有兩方面：(1)在腦缺血發生、發展過程中，清腦益元湯能有效及時阻止神經元細胞凋亡，從而減輕腦損傷；(2)在清腦益元湯組方中含有清熱祛瘀、補腎益精之藥，易能在清熱解毒、活血祛瘀之時，又能起到補腎益元生髓的效果，能有效促進腦缺血損傷后神經元修復，進而促進內源性神經干細胞增殖，達到腦保護作用。