蝦類主要過敏原及其檢測技術的研究進展

左樹娜，苑寧，徐慧，盧鑫，張偉，，3*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.河北農業大學理工學院，河北 滄州 061100；3.河北農業大學生命科學學院，河北 保定 071001）

食物過敏是一個引起世界范圍廣泛關注的健康問題[1]。世界衛生組織指出，全球約有30%～40%的人患過敏性疾病，且患病率呈逐年增長趨勢，已成為全球六大慢性疾病之一[2-3]。聯合國糧食及農業組織公布的引起過敏反應的食物中，90%是由牛奶、雞蛋、魚、甲殼類動物、花生、大豆、堅果和小麥引起的[4]。

蝦、蟹等甲殼類動物是一種富含蛋白質的重要食物資源[5]，因其肉質鮮美而備受歡迎。但蝦作為主要過敏原，其可能會引發消化系統紊亂（腹痛、腹瀉）和皮膚刺激（皮炎、蕁麻疹）或更嚴重的過敏癥狀（血管性水腫、休克、死亡）[6-8]。蝦中主要致敏蛋白有原肌球蛋白（tropomyosin，TM）、精氨酸激酶（arginine kinase，AK）、肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）、肌質鈣結合蛋白（sarcoplasmic calcium binding protein，SCP）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）和血藍蛋白（hemocyanin）等[9-10]。盡管烹飪可使蝦中大部分致敏蛋白變性，但一些耐熱蛋白依然存在致敏性[11]。此外生產、儲存過程中發生的交叉污染也可能導致食物中存在蝦過敏原[12-13]。因此為保障食用安全，除必要的標簽標示之外[14]，對食品中蝦過敏原成分的精準特異檢測至關重要[15]。本文主要介紹蝦過敏機制、5種主要致敏蛋白以及近幾年蝦過敏原的檢測方法。

1 致敏機制

《日本兒科2016年食物過敏指南》（JPGFA 2016）對過敏反應進行了定義，“過敏反應是指接觸特定食物后，通過抗原特異性免疫機制引起的不良反應[16]?！边@些反應包括免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導和非IgE介導的過程[17]。

蝦類過敏是IgE介導的I型超敏反應，其是由肥大細胞或嗜堿性粒細胞上抗原的特異性IgE交聯導致的即時反應，一般在攝入食物20min～120min后出現過敏癥狀[18]。I型超敏反應具體反應機制為，當抗原（蝦類致敏蛋白）進入過敏機體時，該抗原與其特異性IgE結合，在體內循環并與肥大細胞或嗜堿性粒細胞上的Fc受體結合，使機體對抗原產生敏化。當同一抗原再次進入致敏體時，抗原與致敏細胞表面的特異IgE結合，使這些細胞釋放一系列致敏介質，引起過敏反應[19]。

2 主要致敏蛋白

2.1 原肌球蛋白

TM是蝦的主要過敏原，其是一種由100%α-螺旋纖維蛋白構成的螺旋狀二聚體，分子量為34 ku～38 ku，起調節肌肉收縮的作用，廣泛分布于真核細胞中[20-21]。研究發現TM具有較強的耐消化特性，這是由于其存在3個不被破壞的抗原表位和4個抗消化能力很強的抗原表位造成的[22]。Reese等[23]表征重組蝦的致敏蛋白Pen a 1時，TM已經被定義為蝦的主要過敏原且Pen a 1已被分離，對其研究最早可以追溯到1989年。在中國北方沿海地區，蝦類過敏人群中對Pen a 1過敏者高達71.4%[24]。聶澤坤和GáMEI等[25-26]從TM中分離出Mete1、Pen s 1、Lit v 1、Pen i 1、Hom a 1 等亞型[25-26]。甲殼類動物與螨蟲和蟑螂之間的TM的氨基酸具有較高同源性，分別為78%～98%和80%～97%。

2.2 精氨酸激酶

AK是甲殼類動物的一種重要過敏原，分子量為40 ku，其致敏率高達70%，致敏性僅次于TM。但甲殼類動物與軟體動物具有高度同源性，存在非常嚴重的交叉反應[27]。Yu等[28]確定Pen m 2為AK的一個新亞型，并在其中發現了特定的肌動蛋白結合結構域，推測Pen m 2可能具有調節或運輸特性。在具有蝦過敏病史或對蝦提取物的ImmunoCAP呈陽性患者外周血單核細胞進行檢測時，發現TH2細胞可識別Pen m 2，且其發揮著重要的致病作用[29]。基于此，2019年Gao等[30]提出了一種T細胞肽的免疫療法（T cell peptide immunotherapy，PIT）以減輕蝦過敏原AK誘導的食物過敏，這是一種無需IgE交聯即可調節過敏反應的治療策略，其最早被Wang等[31]提出治療TM導致的過敏反應。

2.3 肌球蛋白輕鏈

MLC在2008年被認定是一種蝦類過敏原，命名為Lit v 3.0101[32]，但目前對其過敏表位的研究較少。Yang等[33]對克氏原螯蝦的肌球蛋白輕鏈亞型1（MLC1）進行了研究，得到了3個構象表位區域，為進一步的診斷或抗原研究提供了重要依據。

2.4 肌質鈣結合蛋白

SCP是存在于無脊椎動物肌肉和神經組織中的EF-手型鈣離子結合蛋白，主要參與肌肉的收縮，其亞型種類有 Pen m 4、Cra c 4、Lit v 4[34]。其中 Lit v 4.0101有194個氨基酸，分子量為22 ku，等電點為4.7。Ayuso等[35]研究表明，甲殼類動物、節肢動物和軟體動物間均存在致敏成分TM，但SCP的致敏性似乎僅存在于甲殼類動物中。

2.5 丙酮酸激酶

PK是甲殼類動物中催化轉化和轉移反應重要的酶。2018年Lee等[36]分析了蝦、蟹過敏患者的血清，發現了一個63 ku的致敏蛋白，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、 免 疫 印 跡（western blotting，WB） 和質譜法（mass spectrometry，MS）對其進行研究，并首次確定為一種新型的蝦過敏原。

2.6 血藍蛋白

血藍蛋白是由6個高度螺旋異源亞基構成的六聚體，其分子量為72 ku或75 ku，具有良好熱穩定性和耐胰液消化特性，不僅具有輸氧、抗病毒、溶血等功能，而且在滲透壓維持、免疫因子表達和能量轉換等生理過程中具有一定的調控作用[37-40]。在西班牙和意大利，血藍蛋白被認為是蝦類致敏原之一，但在美國，其被認為是節肢動物和蝦之間的交叉反應性致敏原[41]。

除以上6種主要的蝦類過敏原以外，蝦中還有肌鈣蛋白（troponin C，TnC）[42-43]、磷酸丙糖異構酶（triosephosphate isomerase，TIM）[44]等次要過敏原。

3 蝦類過敏原的檢測方法

3.1 免疫學方法

3.1.1 酶聯免疫吸附測定

酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作為最典型的免疫學方法被廣泛用于蝦類過敏原的檢測分析。

Kamemura等[19]使用ELISA和IgE交聯誘導熒光素酶表達測定試驗（IgE crosslinking-induced luciferase expression assay，EXiLE）方法證實了甲殼類和食用昆蟲間存在著交叉過敏現象，以原肌球蛋白為發生交叉反應的主要過敏原。此研究表明對IgE抗體介導的食物過敏反應進行評估時，可能會因交叉反應而變得復雜。Yu等[45]開發了一種夾心ELISA檢測加工食品中蝦、蟹過敏原TM的方法，其檢出限（limit of detection，LOD）為 6.8 ng/mL，定量限（limit of quantitation，LOQ）為13.67 ng/mL。李曉燕等[46]利用雙抗體夾心ELISA法測定食物中蝦過敏原成分，最低檢出限為40 ng/mL，并且在40 ng/mL～1 000 ng/mL之間具有良好的線性關系。Zhang等[47]成功獲得了特異性強、敏感性高的單克隆抗體CE7B2，利用夾心ELISA方法檢測并定量了包括蝦在內的16種無脊椎動物的TM，其中斑節蝦（Marsupenaeus japonicus）的TM的檢出限為0.09 ng/mL。

ELISA方法對于食品安全檢測具有一定意義，但在檢測深加工食品時，其致敏蛋白的一級結構被破壞易造成假陰性結果。

3.1.2 側流免疫層析分析法

側流免疫層析分析法（lateral flow immunoassay，LFIA）是近些年較常用的免疫學分析檢測技術。其原理是基于競爭結合的方式，以硝酸纖維素膜為載體，通過在濾膜的檢測線和控制線上固定不同成分，以捕獲抗原與熒光物質-單克隆抗體的復合物，捕獲后進行抗原-抗體反應，通過肉眼觀察膜上的顯色現象判定結果。

Wang等[48]建立了基于量子點的熒光側流免疫層析分析法檢測甲殼類動物中的TM，30 min內即可判定結果，肉眼可視化檢出限為0.5 μg/mL，儀器監測熒光檢出限為 0.05 μg/mL。

LFIA具有良好的特異性和重復性，但操作時要求加樣精準，操作不當將產生假陰性或假陽性結果，在一定程度上限制了其廣泛應用。

3.2 超高效液相色譜與質譜聯用技術

質譜法（mass spectrometry，MS）是一種分子裂解后形成的離子按照其質量和電荷的比值（質荷比）大小依次排列成譜，從而記錄數據的方法。近年來，在質譜儀器、分析軟件和各種化學工具發展的推動下，MS得以快速發展[49]。MS已成為一種研究蛋白質組學的常用技術，其基于肽段進行定性或定量分析，可避免因加工處理樣品時破壞蛋白質空間結構而影響檢測結果，因此，MS檢測過敏原時比其他基于蛋白質的方法更具優勢，且提高了檢測效率[50]。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是20世紀70年代在經典液相色譜和氣相色譜的基礎上，發展起來的一項高效靈敏的分離分析技術，可大大提高分離效率。近年來，基于液相色譜-質譜聯用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）或高效液相色譜串聯質譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）的定量蛋白質組學方法被廣泛應用于過敏原分析中，其為過敏原的檢測提供了更為有力的分析策略[51]。

李紫薇等[52]使用超高效液相色譜-飛行時間質譜（ultra-performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）對酶解后的南極磷蝦（Euphausia superba）肽段進行了分離檢測，并結合美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI） 蛋白數據庫、Skyline生物信息學軟件和三重四極桿質譜對酶解肽段進行驗證，鑒定出南極磷蝦中兩種主要過敏原為TM和AK。Khanaruksombat等[53]使用LC-MS/MS結合SDSPAGE和WB對21例香蕉蝦（Fenneropenaeus merguiensis）不同位置過敏的患者血清進行過敏原的測定，結果表明其肌肉和外殼中主要過敏原是AK，而卵巢中的主要過敏原是卵黃蛋白。

3.3 分子生物學方法

3.3.1 聚合酶鏈式反應及其衍生技術

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）作為最原始的分子檢測技術，其應用范圍甚廣。隨著人們生活水平的提高，對檢測技術的要求越來越嚴苛，普通PCR已經無法滿足人們的需求，以PCR為基礎的一系列衍生技術應運而生，其中實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）為最常用的方法。

實時熒光PCR定量檢測技術是在PCR的基礎上結合探針或熒光染料，通過熒光信號強度的變化判定結果，是一種有效的定量工具。Fernandes等[54]建立了一種針對多品種蝦類的實時熒光定量PCR系統檢測蝦類過敏原，并針對16S rRNA線粒體基因設計了特異性引物和探針。此方法可精準定量檢測食品基質中的微量蝦類過敏原，且有較高的靈敏度和較低的檢出限。蝦DNA的LOD為0.1 pg，蝦與醬的二元混合物的LOQ可達0.000 1%。M?DE等[55]選擇線粒體16S rRNA基因作為檢測食品中甲殼類動物的特異性基因，并設計了7對特異性引物和2組TaqMan探針，建立了實時熒光定量PCR系統，其LOD95%為約每個反應2.96個拷貝數。該研究著重強調了MgCl2和退火溫度均可能影響實時熒光定量PCR反應的靈敏度。

除qPCR以外，近些年液滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[56]、多重 PCR（multiplex PCR，MPCR）[57]也被廣泛用于過敏原的檢測。Suh等[58]利用多重PCR結合毛細管電泳法對包括凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）在內的8種海鮮（共5對特異性引物）的過敏原進行測定，凡納濱對蝦的LOD為0.016 ng。此方法可實現海鮮產品中多個致敏性軟體動物同時且高效的檢測，在加工食品中貝類過敏原的預防、標記和監測方面起到重要作用。

PCR及其衍生技術所需儀器均較昂貴且變溫循環耗時長，限制了其廣泛推廣。

3.3.2 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種常用的DNA擴增技術，需4條～6條引物和Bst DNA聚合酶在60℃～65℃進行體外等溫擴增。

Sheu等[59]利用LAMP方法實現了食品中蝦類過敏原快速、靈敏的檢測，此方法的LOD為0.01%，靈敏度為10-3ng，其靈敏度比PCR高100倍。

LAMP反應不需要昂貴的變溫設備，但引物的設計和反應體系復雜，且引物間易相互作用，產生非特異性結果。

3.4 傳感器

傳感器作為一種新興的技術，具有靈敏度高、特異性強、可以與其他技術和特殊材料結合的特點，該技術被廣泛應用于各個領域。

3.4.1 表面等離子體共振

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）是基于一種光學現象而建立的方法，即發生全反射產生的消逝波與介質中的等離子波共振，使反射光能量減弱，折射指數改變，從而對蛋白質定量。

Zhou等[60]利用表面等離子體共振傳感器與金生物芯片定量檢測了TM，其可以消除復雜貝類樣品的基質干擾。該方法的LOD為1.0μg/mL，LOQ為2.5μg/mL。食品樣品中TM的回收率為92.0%～108.0%，表明該方法具有較好的準確度。

SPR方法對生物分子無任何損傷，且不需任何標記物，響應速度較快。

3.4.2 適配體生物傳感器

適體是通過指數富集的配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）經體外篩選獲得的一小段寡核苷酸序列或短的多肽，在傳感器中可與相應的配體特異性結合，其親和力高、特異性強[61]。

Chinnappan等[62]開發了一種與氧化石墨烯（graphene oxide，GO）聯用的適配體生物傳感器，30 min內可靈敏且特異地檢測原肌球蛋白（TM）。該傳感器使用熒光素染料標記單鏈適體，構建GO-適體復合物，通過GO的π堆積相互作用淬滅適體的熒光；而當TM存在時，適體會首先與TM結合，適體從GO表面脫離，熒光恢復。通過記錄熒光強度的變化，檢測食品中是否含有TM。此傳感器使用較短的適體序列，提高了靈敏度，最低檢測限為2 nmol/L，且具有較高回收率。

3.4.3 金納米粒子生物傳感器

金納米粒子（gold nanoparticle，AuNP）是一種直徑為1 nm～100 nm的納米材料，其粒徑不同則呈現不同的顏色。因其電子密度很高，常被用作電鏡測試的標記物。

Wang等[63]開發了一種基于金納米粒子的生物傳感器，主要用于貝類過敏原原肌球蛋白（tromyosin，TROP）的定性和定量檢測。通過檢測TROP單克隆抗體、AuNPs和TROP的復合物的三向色性（circular dichroism，CD）信號變化判斷結果。樣品中游離抗原作為抑制劑，其越多則形成的復合物越少，CD信號越小，根據信號強度可直接判定檢測結果。該生物傳感器可在0.1 ng/mL～15 ng/mL選擇性測定TROP，LOD為21 pg/mL，LOQ為70 pg/mL。此生物傳感器具有較強的特異性和準確性，且樣品制備簡單，在檢測貝類相關產品及其他的食物過敏原時具有良好適用性。

3.4.4 納米磁珠生物傳感器

近些年，納米磁珠被廣泛用于傳感器技術的開發。傳感器與納米磁珠結合，其靈敏度大大提高，檢出限有所降低，操作也變得簡單易懂，具有潛在的應用價值。

Zhang等[64]采用基于磁納米顆粒的熒光分析法對食品基質中過敏原TM進行檢測。此傳感器將功能化磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）作為分離載體，以OliGreen染料作為信號探針，可以與單鏈DNA特異結合，發出強烈的熒光信號。當TM存在時，TM與適體結合，導致適體-MNPs復合物構象發生變化，適體被釋放到上清液中。加入OliGreen染料后，其與上清液中的適體結合，熒光信號增強超過1 000倍。該方法檢測食品中TM的LOD為77 ng/mL。

3.4.5 熒光磁珠細胞傳感器

Jiang等[65]開發了基于熒光磁珠的新型電化學細胞傳感器，通過產生的特定電化學信號準確檢測和評估食品基質中各種過敏原，其中蝦過敏原Pen a 1的檢出限為0.03 μg/mL。與2013年該團隊開發的細胞傳感器相比[66]，該傳感器檢測更靈敏，其檢出限降低了一個數量級。

電化學傳感器可與免疫學方法、分子生物學方法和細胞檢測相結合，實現食品中過敏物質的高效、靈敏檢測。這些技術的開發和應用可在一定程度上提高食品安全監控的力度[67]。

4 展望

蝦類物質引起的食物過敏隨著人們對蝦需求量的不斷增加而呈現持續上升的趨勢，對蝦致敏蛋白和檢測技術的深入研究至關重要。今后應持續發掘蝦類新的過敏原以及加深對過敏原的研究，拓寬對現有過敏原的認知度。另一方面，應綜合現有檢測方法的優勢，開發更加低廉、便捷、高效、強特異性、高靈敏度的先進檢測技術和微型化、智能化的檢測設備，以實現高通量現場檢測，降低食物過敏的風險，最大程度保障過敏患者的安全健康。