P16、P53、Ki-67在食管上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)及診斷意義

張文書，王珍玲，肖 海，李偉松

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，江西 贛州 341000）

食管上皮內(nèi)瘤變目前WHO 分為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變是指輕度異型增生的上皮細(xì)胞不超過(guò)全層的1/2。高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變是指中重度異型增生的上皮細(xì)胞超過(guò)全層的1/2。在實(shí)際工作中，我們發(fā)現(xiàn)一部分低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變病例主要表現(xiàn)為高級(jí)別核型的異型細(xì)胞位于基底層，它的預(yù)后不好應(yīng)視為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變來(lái)干預(yù)處理。目前關(guān)于這部分病例還無(wú)統(tǒng)一的命名，我們暫時(shí)把它稱為食管基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變，也有學(xué)者建議把它稱為基底層鱗狀細(xì)胞原位癌。

食管基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變應(yīng)作為一個(gè)獨(dú)特組織學(xué)亞型，是指高級(jí)核型的上皮細(xì)胞不超過(guò)全層的1/2，主要位于基底層，一般表現(xiàn)為低級(jí)別結(jié)構(gòu)異型性的高級(jí)別瘤變（低級(jí)別結(jié)構(gòu)異型性高級(jí)別細(xì)胞異型性細(xì)胞層次少，往往集中于下1/2，極性紊亂）。對(duì)于這種病變?cè)谂R床治療上應(yīng)按高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變處理，按現(xiàn)在WHO 的診斷標(biāo)準(zhǔn)只能放在低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中，這會(huì)導(dǎo)致延誤治療。所以對(duì)這種病變的正確認(rèn)識(shí)和診斷非常重要，但這種病變目前由于病理醫(yī)生對(duì)其認(rèn)識(shí)不足，病理診斷受病理醫(yī)師主觀影響，可重復(fù)性差，易導(dǎo)致臨床漏診或過(guò)度治療。為此尋找一組客觀的免疫組化檢查指標(biāo)顯得非常重要，應(yīng)用免疫組化標(biāo)記，為規(guī)范化病理學(xué)診斷提供客觀依據(jù)［1-4］。李旭等［5］研究表明P16、Ki-67 在宮頸鱗狀上皮病變分級(jí)診斷中具有非常重要的意義。P16 蛋白有抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用，在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)［2，6］。Ki-67 是一種細(xì)胞增殖活性相關(guān)抗原，免疫組化染色陽(yáng)性率高說(shuō)明細(xì)胞增生活躍。P53是一種抑癌基因，賈振軍等［7］研究表明P53 在食管癌的癌旁組織中可檢測(cè)到表達(dá)，其檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)早期癌及癌前病變。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019 年本院食管黏膜活檢小標(biāo)本，取確診為食管癌的癌旁組織，標(biāo)本經(jīng)10% 中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，4 μm 厚切片，HE 染色，顯微鏡下觀察閱片篩查出低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變25 例和基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變16 例兩組標(biāo)本，并全部進(jìn)行P16、P53、Ki-67 免疫組化染色檢查。

1.2 免疫組化單克隆抗體P16、P53、Ki-67 購(gòu)自羅氏公司，采用羅氏自動(dòng)免疫組化染色機(jī)（Bench?Mark ULTRA）進(jìn)行免疫組化染色，實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行。用已知陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照，采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變表現(xiàn)為病變細(xì)胞集中在上皮的下1/3 層，病變細(xì)胞極性輕度紊亂，細(xì)胞核輕度異型（圖1）。基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變表現(xiàn)為上皮的基底層和副基底層細(xì)胞極性紊亂，細(xì)胞核異型明顯（圖2）。P16陽(yáng)性位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，染色模式為彌漫型，顯示相應(yīng)病變的基底層和副基底層的細(xì)胞連續(xù)染色，P16 判讀為（+），鱗狀上皮無(wú)染色、孤立細(xì)胞或小細(xì)胞群的染色（斑駁狀染色）均判定為（-）。P53 陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，P53 陽(yáng)性表達(dá)局限于上皮基底層為（-），超過(guò)基底層，占全層5%～25%為（+），26%～75%為（++），＞75%為（+++）。Ki-67 陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，Ki-67 陽(yáng)性表達(dá)局限于上皮基底層為（-）；超過(guò)基底層，占全層10%～25%為（+），26%～75%為（++），＞75%為（+++）。（-）和（+）為陰性，（++）和（+++）為陽(yáng)性［8-9］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 食管低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，×200）

圖2 食管高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，×200）

2 結(jié) 果

2.1 P16、P53和Ki-67在食管低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變和基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的陽(yáng)性表達(dá)P16在兩組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.288 281，P=0.591 324）；P53 的表達(dá)在基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變組明顯高于低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.427 250，P=0.006 424）；Ki-67 的表達(dá)在基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變組明顯高于低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.879 822，P=0.008 717）（圖3、表1）。

圖3 食管基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變免疫組化表達(dá)（羅氏自動(dòng)免疫組化染色機(jī)染色，×200）

表1 P16、P53、Ki-67 在食管低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)情況/n（%）

2.2 P53 與Ki-67 的關(guān) 聯(lián) 性P53 和Ki-67 在食 管低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變和基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.6875，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 P53與Ki-67的關(guān)聯(lián)性/n

3 討 論

P16 是一種抑癌基因，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失調(diào)，在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)［2-4］，其陽(yáng)性表達(dá)率在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中隨著級(jí)別的升高增強(qiáng)，呈垂直性分布。在本次研究中發(fā)現(xiàn)P16在食管低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變與基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中表達(dá)無(wú)差異，這可能跟它們各自主要的病因不同有關(guān)系，子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變其主要的病因是人乳頭狀瘤病毒的感染。而食管鱗狀上皮內(nèi)瘤變主要跟患者的飲食習(xí)慣、長(zhǎng)期的慢性炎癥刺激以及遺傳因素有關(guān)。

Ki-67是一種細(xì)胞增殖活性相關(guān)抗原，是惡性腫瘤預(yù)后的重要參考指標(biāo)之一。Ki-67蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核內(nèi)，在增殖細(xì)胞的G1、S、G2和M期表達(dá)，G0期不表達(dá)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67 在食管低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變與基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中表達(dá)存在差異，在基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變Ki-67的表達(dá)高達(dá)75%，提示基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的異型上皮增殖率較高，說(shuō)明Ki-67蛋白的表達(dá)在食管基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的診斷中有參考意義。

P53是一種重要的抑癌基因，主要是阻止G1/G0期，使細(xì)胞不能進(jìn)入S 期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖，與人類惡性腫瘤相關(guān)性很高。P53 異常出現(xiàn)在腫瘤的早期和癌前病變中，因此認(rèn)為P53 是一種常見(jiàn)的遺傳事件。研究發(fā)現(xiàn)P53在食管癌的癌旁組織中也可檢測(cè)到表達(dá)，其檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)早期癌及癌前病變［7］，陳麗霞等［11］研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白在正常食管黏膜組織中未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，在輕度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生以及癌組織中表達(dá)率分別為13.3%、31.2%、62.6%、68.0%，在食管癌組織中的表達(dá)可達(dá)100%。本次研究顯示P53 在食管低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中表現(xiàn)為病變的鱗狀上皮細(xì)胞散在細(xì)胞核陽(yáng)性，在基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中表現(xiàn)為基底層和副基底層病變細(xì)胞核彌漫陽(yáng)性。P53 在食管低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變和基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的陽(yáng)性率分別為16%、62.5%，P53的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），提示P53基因突變?cè)谑彻艿镊[狀上皮內(nèi)瘤變得不斷進(jìn)展過(guò)程中可能起一定的作用。

綜上所述，食管鱗狀上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，P16 的表達(dá)在診斷低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變和基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的區(qū)別上沒(méi)有明顯的差異，不具有診斷參考價(jià)值。P53和Ki-67 的表達(dá)在食管低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變和基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的區(qū)別上具有明顯的差異，結(jié)合兩者的檢測(cè)和組織細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)有助于降低基底層高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的漏診率。