p21 激活酶2 在膀胱癌組織中的表達及對癌細胞活性的影響

趙偉

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 新疆 烏魯木齊 830000）

膀胱癌是臨床中最為常見的一種泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴重危害人們健康[1]。p21 激活酶2（PAK2）是PAK 家族重要成員，PAK 家族在轉錄因子調(diào)控、細胞生長、細胞分裂凋亡等過程中起到了重要作用[2]。通過免疫組織化學法對膀胱癌組織及癌旁組織中PAK2 表達情況進行了檢測，旨在分析其與臨床病理特征的關系，及其對癌細胞活性的影響。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取醫(yī)院2018 年1 月—2020 年4 月接受手術治療的膀胱癌患者68 例，均為尿路上皮癌。手術切除患者膀胱癌組織及癌旁組織分別作為膀胱癌組和癌旁組。詳細收集患者的一般資料，主要包括年齡、性別、TNM 分期、組織分化程度、有無淋巴結轉移等。68 例患者中，男性47 例，女性21 例；年齡52 ～78 歲，平均年齡（62.09±5.46）歲。

1.2 方法

1.2.1 PAK2 陽性率檢測 通過免疫組織化學法檢測膀胱癌組織和癌旁組織PAK2 陽性率，取甲醛溶液固定膀胱癌組織和癌旁組織，開展石蠟包埋和連續(xù)切片（厚度4mm），再實施常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水處理，用3%過氧化氫封閉處理內(nèi)源性過氧化物酶，并對標本實施常規(guī)脫蠟，再開展微波抗原修復，于10%山羊血清封閉組織內(nèi)加入非特異性抗原開展操作，并加入適量兔抗人ER 和PR 抗體，抗體均購自南京福麥斯生物科技有限公司，在4℃的冰箱內(nèi)孵育24h，用PBS 緩沖溶液替代一抗作陰性對照；同時，于次日滴加適量的羊抗兔二抗（PAK2 蛋白二抗均經(jīng)生物素標記），實施SP（免疫組化）染色及DAB 顯色，用蘇木素實施復染，選擇中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察，將已知的膀胱癌陽性切片視作陽性對照。于400 倍顯微鏡下隨機選取視野5 個，觀察視野內(nèi)陽性細胞計數(shù)、總細胞計數(shù)，通過半定量積分法實施結果判定：①按每張切片內(nèi)細胞染色強度進行評分，無顯色計0 分，淺黃色染色計1 分，棕黃色染色計2 分，棕褐色染色計3 分。②按組織切片內(nèi)陽性染色細胞數(shù)和總腫瘤細胞數(shù)的比值實施評分，若0 分：比值≤5%，1 分：＞5%～25%，2分：＞25%～50%，3 分：＞50%～75%，4 分：比值＞75%。將上述兩項評分相乘獲取總評分，總評分為0 分代表陰性（-），1 ～12 分代表陽性。

1.2.2 Transwell 實驗測定細胞遷移和侵襲能力 于低溫條件下將無血清培養(yǎng)基調(diào)制為1mg/ml 的Matrigel 膠溶液，均勻鋪于上室，每室為20μl，保存于溫箱中。向下室加入500μl甘油10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，用無牛清培養(yǎng)基將轉染CD511B 或者PAK2 質粒的T24 細胞配制成為5×105/ml 細胞懸液，然后均勻覆蓋于膠上，每室約200μl，放置于二氧化碳體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱，溫度控制在37℃，時間為24h。將室內(nèi)液體傾去，再放置于4%多聚甲醛溶液中固定30min，溫度為室溫，在風干之后取2%結晶紫進行染色，時間為30min，將聚碳脂膜內(nèi)側面的細胞擦去，于顯微鏡下對外側面細胞進行觀察，隨機選取5 個高倍鏡視野，對穿膜細胞數(shù)進行計數(shù)，每組各3 個復孔。遷移實驗同上，無需放置Matrigel 膠，在細胞接種20h 之后進行固定及染色，同樣各3 個復孔。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料應用均數(shù)±標準差（±s），采用t檢驗；計數(shù)資料以百分數(shù)（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 膀胱癌組及癌旁組PAK2 表達水平比較

膀胱癌組PAK2 陽性41 例（60.29%），顯著高于癌旁組的12 例（17.65%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=26.000，P＜0.05）。見圖1。

圖1 A：PAK2 在膀胱癌組織中的陰性表達；B：PAK2 在癌旁組織中的陽性表達（×400）

2.2 膀胱癌患者臨床病理特征與PAK2 表達的關系

PAK2 在膀胱癌組織中的表達與年齡、性別、腫瘤直徑無關（P＞0.05），與TNM 分期、組織分化程度、淋巴結轉移相關（P＜0.05），見表1。

表1 膀胱癌患者臨床病理特征與PAK2 表達的關系[n（%）]

2.3 過表達PAK2 對癌細胞遷移和侵襲能力的影響

過表達MTA2 穩(wěn)轉T24 細胞侵襲以及遷移數(shù)目均顯著高于CD511B 穩(wěn)轉，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 過表達PAK2 對癌細胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

表2 過表達PAK2 對癌細胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

組別 侵襲數(shù)目 遷移數(shù)目CD511B 穩(wěn)轉 30.89±4.06 32.00±2.09 MTA2 穩(wěn)轉 51.94±4.15 65.00±6.72 t 6.280 8.122 P 0.000 0.000

3.討論

臨床中，大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的主要原因為病灶轉移及侵襲，因而了解癌細胞侵襲及轉移機制具有重要意義[3]。近年來，隨著分子檢測手段的不斷發(fā)展進步，惡性腫瘤相關基因表達情況已經(jīng)成為臨床研究的一個熱點。PAK2 廣泛存在機體各組織器官中，PAK2 具有獨特的作用，可以通過活化細胞外調(diào)節(jié)激酶加快細胞生長，還可以在細胞凋亡信號作用下引起細胞凋亡[4]。

眾多研究顯示，在甲狀腺癌、結腸癌、宮頸癌以及乳腺癌等惡性腫瘤中PAK2 均呈高表達，與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關[5-6]。本結果顯示，膀胱癌組PAK2 陽性率顯著高于癌旁組，且與TNM 分期、組織分化程度、淋巴結轉移相關，說明PAK2 可以在一定程度上反映膀胱癌患者TNM 分期、組織分化程度、淋巴結轉移，可作為患者病情進展情況評估的重要指標。

膀胱癌侵襲能力比較強，不過具體作用機制尚未完全明確。研究顯示，下調(diào)PAK2 表達可抑制癌細胞生長增殖。本文中，在膀胱癌T24 細胞系中過表達MTA2 之后，癌細胞的侵襲及遷移能力均顯著增強[7]。其原因可能與通過PAK/MAPK/HSP27 信號通路活化、PAK2磷酸化等有關[8]，進而發(fā)揮出促進癌細胞侵襲及轉移，不過具體作用機制還需要進一步研究。

綜上所述，膀胱癌組織中PAK2 陽性表達率較高，與膀胱癌的發(fā)展相關，且可以促進癌細胞的侵襲以及轉移。