miR-411-5p 在結直腸癌中的表達及其細胞生物學功能分析

易深根 劉波 鄭瑛 甘偉 劉奎杰 曾嘉 曾蓉 陳翔 歐陽國慶 陳衛東（通訊作者）

（中南大學湘雅二醫院 湖南 長沙 410000）

結直腸癌是臨床中發病率及死亡率均較高的一種惡性腫瘤，其中復發轉移是患者死亡的重要原因[1]。由于結直腸癌早期缺乏典型臨床癥狀，且臨床上缺乏早期診斷的特異性生物分子標志物，因而大多數患者確診時已經處于中晚期。近年來，隨著分子檢測手段的不斷發展進步，惡性腫瘤相關基因表達情況已經成為臨床研究的一個熱點。微小RNA（mi-RNA）具有多種生物學功能，包括調節細胞增殖、遷移、死亡、組織代謝、個體發育以及神經細胞分化等[2]。研究顯示[3]，miR-411-5p 在膀胱癌、胃癌、宮頸癌、乳腺癌中均出現異常表達。本研究通過實時熒光定量PCR（Q-PCR）對結直腸癌組織及癌旁組織中miR-411-5p表達情況進行檢測，旨在分析其與臨床病理特征的關系，及其對細胞生物學功能的影響。現將結果報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取醫院2019 年1 月—2020 年4 月接受手術治療的結直腸癌患者50 例作為研究對象，手術切除患者結直腸癌組織作為結直腸癌組，選取距病灶邊緣＞5cm 的癌旁組織作為癌旁組，所有癌旁組織均經術后病理學檢查無癌組織殘留。詳細收集患者的一般資料，主要包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM 分期、組織分化程度、淋巴結轉移。50 例患者中男性29 例，女性21 例；年齡34 ～78 歲，平均年齡（60.29±7.46）歲；腫瘤部位：直腸26 例，結腸24 例；TNM 分期：Ⅰ期11 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期8 例；有淋巴結轉移21 例，無淋巴結轉移29 例。

1.2 方法

1.2.1 材料及儀器 結直腸癌細胞株DLD1 購自中國科學院細胞庫，熒光定量PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司，靶基因引物、RPMI-1640、胎牛血清購自美國HyClone 公司，逆轉錄試劑盒、轉染試劑盒、miR-411-5p negative、miR-411-5p mimic 由上海吉瑪公司提供。

1.2.2 Q-PCR 測定miR-411-5p 相對表達量 取大小適宜的結直腸癌組織和癌旁組織，通過TRizol 法提取RNA，濃度測定之后使用逆轉試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，取1μL 的cDNA，通過PCR 試劑盒擴增及檢測miR-411-5p 的表達，以2-ΔΔCt 計算miR-411-5p 相對表達量。PCR 反應體系總體積為20μl，PCR 擴增：95℃預變性，時間為5min，變性40s，退火至60℃，時間維持40s，再延伸至72℃，時間持續40s，重復循環40 次。上游引物的序列為5’-GCTCCGGTAGGTCACG-3’，下游引物的序列為5’-CCTGGGTCAAGTGTCGGAG-3’。

1.2.3 細胞培養及轉染 將結直腸癌細胞株DLD1 培養于含有1%青鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，放置于5%二氧化碳飽和濕度的恒溫培養箱中進行培養，溫度控制在37℃，按照轉染試劑盒說明書進行轉染，分為轉染組、陰性對照組和空白組。

1.2.4 Transwell 實驗 （1）遷移實驗：取各組轉染后培養48 h 細胞，于胰酶消化之后收集細胞，使用無血清的RPMI-1640培養基重懸，配制成為2×105/ml 細胞懸液，取200μL 放置于Transwell 小室上室，將800μl 的含有20%胎牛血清的培養液加入Transwell 小室下室，放置于二氧化碳體積分數為5%的培養箱，溫度控制在37℃，時間為24h。將室內液體傾去，再放置于4%多聚甲醛溶液中固定30min，溫度為室溫，在風干之后取2%結晶紫進行染色，時間為30min，將聚碳脂膜內側面的細胞擦去，于顯微鏡下對外側面細胞進行觀察，隨機選取5 個高倍鏡視野，對穿膜細胞數進行計數，每組各3 個復孔；（2）于低溫條件下將無血清培養基調制為1mg/mL 的Matrigel 膠溶液，均勻鋪于Transwell 上室，在風干之后以備用。剩余步驟同遷移實驗。

1.3 觀察指標

（1）比較結直腸癌組和癌旁組miR-411-5p 相對表達量；（2）分析結直腸癌患者臨床病理特征與miR-411-5p 相對表達量的關系；（3）比較miR-411-5p 轉染組、陰性對照組和空白組對癌細胞侵襲、遷移能力。

1.4 統計學處理

采用SPSS20.0 統計軟件對數據進行處理，計量資料應用平均值±標準差（±s）表示，采用t檢驗和方差分析，計數資料與百分數（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 結直腸癌組和癌旁組miR-411-5p 相對表達量比較

結直腸癌組miR-411-5p 相對表達量為（0.78±0.23），顯著低于癌旁組的（1.94±0.27），差異有統計學意義（t=-23.126，P＜0.05）。

2.2 結直腸癌患者臨床病理特征與miR-411-5p 相對表達量的關系

miR-411-5p 在結直腸癌組織中的表達與年齡、性別、腫瘤直徑以及腫瘤部位無關（P＞0.05），與TNM 分期、淋巴結轉移、組織分化程度相關（P＜0.05）。見表1。

表1 結直腸癌患者臨床病理特征與miR-411-5p 相對表達量的關系（±s）

表1 結直腸癌患者臨床病理特征與miR-411-5p 相對表達量的關系（±s）

項目 例數 miR-411-5p 相對表達量 t 值 P 值性別男29 0.81±0.25 1.027 0.310女21 0.74±0.22年齡（歲）＜60 18 0.82±0.27 1.531 0.132≥60 32 0.72±0.19 TNM 分期Ⅰ期+Ⅱ期 25 0.89±0.28 3.816 0.000Ⅲ期+Ⅳ期 25 0.64±0.17組織分化程度高分化+中分化 36 0.93±0.29 3.791 0.000低分化 14 0.62±0.15腫瘤直徑（cm）＜5 22 0.83±0.24 1.152 0.255≥5 28 0.76±0.19淋巴結轉移有21 0.59±0.16 -5.919 0.000無29 1.04±0.32腫瘤部位直腸 26 0.75±0.19 -1.513 0.137結腸 24 0.84±0.23

2.3 miR-411-5p 上調對癌細胞遷移和侵襲能力的影響

轉染組遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著低于陰性對照組和空白組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；陰性對照組和空白組遷移細胞數和侵襲細胞數比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 miR-411-5p 上調對癌細胞遷移和侵襲能力的影響（±s，個）

表2 miR-411-5p 上調對癌細胞遷移和侵襲能力的影響（±s，個）

注：與轉染組比較，aP ＜0.05。

組別 遷移細胞數 侵襲細胞數轉染組 75.28±8.34 84.87±7.14陰性對照組 136.49±26.83a 152.26±29.05a空白組 141.56±28.69a 157.19±31.78a F 值 31.047 46.452 P 值 0.000 0.000

3.討論

在惡性腫瘤及其發病機制當中，mi-RNA 所起到的作用越來越受到專家學者的重視[4]。近年來，隨著相關研究技術的進步以及認識的不斷深入，人們對結直腸癌mi-RNA 的研究已經取得了較大的進展，已經發現多種與惡性腫瘤病理過程有密切關系的mi-RNA，如mi-RNA-98、mi-RNA-3960 等[5]。mi-RNA 幾乎參與了絕大多數細胞生物學的進程，包括細胞侵襲、轉移、增殖、分化、凋亡等。mi-RNA 可通過調控靶基因、激活受體蛋白以及結合功能蛋白等方式影響惡性腫瘤的發生及發展。

研究顯示[6-7]，miR-411-5p 在肝癌等惡性腫瘤中呈低表達，且在乳腺癌骨轉移早期診斷中具有較高的臨床應用價值。本研究結果顯示，結直腸癌組miR-411-5p 相對表達量顯著低于癌旁組，表明結直腸癌組織中miR-411-5p 相對表達量較低。mi-RNA與惡性腫瘤發生及發展密切相關，本研究結果顯示，miR-411-5p在結直腸癌組織中的表達與年齡、性別、腫瘤直徑以及腫瘤部位無關，與TNM 分期、淋巴結轉移、組織分化程度相關，說明miR-411-5p 可以在一定程度上反映膀胱癌患者TNM 分期、組織分化程度、淋巴結轉移，可作為患者病情進展情況評估的重要指標。

臨床中，大多數惡性腫瘤患者死亡的主要原因為病灶轉移及侵襲，因而了解癌細胞侵襲及轉移機制具有重要意義。吳克盛等[8]的研究指出，上調miR-411-5p 表達可以抑制胃癌細胞遷移。本研究中，轉染組遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著低于陰性對照組和空白組，說明特異性上調miR-411-5p 表達可以有效減少結直腸癌細胞侵襲及遷移能力，提示miR-411-5p 可能影響了結直腸癌細胞侵襲及遷移。

綜上所述，結直腸癌組織中miR-411-5p 相對表達量較低，與結直腸癌的發生、發展相關，且表達水平上調可以抑制癌細胞的侵襲以及轉移。不過由于結直腸癌發生涉及多步驟及多基因，miR-411-5p 在發生及進展中的作用機制需要進一步研究。