內(nèi)源乳化凝膠法制備嗜酸乳酸桿菌微膠囊肉雞飼喂效果研究

李 龍,李文鳳

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物工程分院，陜西 楊凌 712100)

益生菌作為一種微生態(tài)制劑已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中[1]。益生菌在宿主體內(nèi)存活率的高低直接影響到使用效果，但很多益生菌菌株在宿主胃腸道中存活率很低[2]。微膠囊技術(shù)能夠在益生菌表面形成一個(gè)抵抗不利因素的表面屏障，從而能夠有效的將益生菌傳遞至特定位置[3]。受限于產(chǎn)量低和包埋顆粒過大等缺陷，目前微膠囊益生菌還不能廣泛的進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)[4]。

內(nèi)源乳化法是利用凝膠(如海藻酸、果膠和卡拉膠等)將活的細(xì)胞進(jìn)行包埋，其基礎(chǔ)是連續(xù)相(細(xì)胞聚合物懸浮)與分散相(油)之間的關(guān)系。這種方法包被的益生菌在不利環(huán)境下存活率高，包埋顆粒大小適中，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[5]。唾液乳桿菌是乳酸桿菌屬中的一類，在人類和動(dòng)物生產(chǎn)中都被作為益生菌來使用。李龍(2015)[6]研究發(fā)現(xiàn)給飼喂唾液乳酸桿菌LTC-55能夠存進(jìn)肉雞消化酶分泌和腸道發(fā)育，并提高生產(chǎn)性能。本研究擬利用內(nèi)源乳化法制備唾液乳酸桿菌LTC-55微膠囊，并進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)研究其對(duì)肉雞生產(chǎn)性能、免疫機(jī)能和盲腸微生物組成的影響。

1 材料與方法

1.1 微膠囊制備

所用益生菌菌株唾液乳酸桿菌LTC-55為本實(shí)驗(yàn)室從藏雞胃腸道中分離所得[6]。微膠囊制備參照Guan等(2011)[7]推薦的方法操作，并略作修改，將100 mL 1.8%(W/V)海藻酸鈉、5 mL 植物乳桿菌JM113懸菌液(1×108CFU·mL-1)和0.45 g 碳酸鈣混勻后，用滅菌水補(bǔ)足300 mL，將混合液加入石蠟油中(含0.2% Span80)，在磁力攪拌器上以400 rpm的速度乳化5 min，加入900 μL冰醋酸繼續(xù)乳化10 min，再加入100 mL滅菌水使制備好的微珠進(jìn)入水相層，吸取水相層離心清洗三次后，冷凍干燥收集微膠囊包被的益生菌。以未進(jìn)行微膠囊化的益生菌為對(duì)照，使用同樣的方法進(jìn)行冷凍干燥。利用平板計(jì)數(shù)檢測(cè)活菌數(shù)為7.2×108CFU·g-1微膠囊。

1.2 飼養(yǎng)試驗(yàn)

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 480只1日齡雄性AA肉仔雞被隨機(jī)分為至4個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只雞，進(jìn)行為期42d的飼養(yǎng)試驗(yàn)。對(duì)照組飼喂不含抗生素的基礎(chǔ)日糧(對(duì)照組)，益生菌組、空殼組和微膠囊組分別在基礎(chǔ)日糧中添加未包被的益生菌干粉(活菌數(shù)未1×108CFU·kg-1飼料)、0.14 g未包被益生菌的微膠囊空殼和微膠囊益生菌(活菌數(shù)未1×108CFU·kg-1飼料)。整個(gè)試驗(yàn)期肉雞自由采食和飲水，按照AA肉雞常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) 主要有:

(1)生產(chǎn)性能。分別在第21天和第42天時(shí)稱取每個(gè)重復(fù)雞只的體重，并統(tǒng)計(jì)上述階段中該重復(fù)雞只的耗料量和增重，計(jì)算21 d和42 d每個(gè)重復(fù)肉雞的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)。

(2)免疫器官指數(shù)。分別在第21天和第42天每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取2只雞，稱重后翅靜脈采血，分離血清-20℃保存?zhèn)溆谩囝i處死后，立即分離脾臟和法氏囊，稱重后計(jì)算免疫器官指數(shù)(免疫器官重×1 000/雞只體重)。

(3)免疫球蛋白水平。血清免疫球蛋白水平(IgA, IgG和IgM)采用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定(南京建成)，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書規(guī)定程序進(jìn)行。

(4)盲腸微生物。 斷頸處死雞只取盲腸，無菌收集盲腸內(nèi)容物，置于冰上帶回實(shí)驗(yàn)室。稱取1g盲腸內(nèi)容物用無菌生理鹽水(0.85% NaCl)進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取稀釋液100μL涂布于乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌選擇性固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果以log10 CFU·g-1腸道內(nèi)容物表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS17.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以"平均值±標(biāo)準(zhǔn)差"表示，以P<0.05認(rèn)定結(jié)果為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 微膠囊益生菌對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

結(jié)果見表1，由表1可知在21 d和42 d時(shí)相比與對(duì)照組，微膠囊組顯著提高肉雞ADG(P<0.05)。而所有處理組在整個(gè)試驗(yàn)期ADFI和FCR上并無顯著差異(P>0.05)。

表1 微膠囊益生菌對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 微膠囊益生菌對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)和血清免疫球蛋白水平的影響

結(jié)果見表3，由表3可知在21d時(shí)相比于對(duì)照組，益生菌組和微膠囊組顯著提高了肉雞法氏囊指數(shù)、血清IgG和IgM水平(P<0.05)，同時(shí)微膠囊組肉雞血清IgG水平顯著高于益生菌組(P<0.05)。在42 d時(shí)相比于對(duì)照組，益生菌組和微膠囊組顯著提高了肉雞法氏囊指數(shù)、血清IgM水平(P<0.05)，同時(shí)微膠囊組顯著提高了肉雞脾臟指數(shù)和血清IgG水平(P<0.05)。

表2 微膠囊益生菌對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)和血清免疫球蛋白水平的影響

2.3 微膠囊益生菌對(duì)肉雞盲腸微生物組成的影響

結(jié)果見表3，由表3可知在21 d時(shí)相比于對(duì)照組益生菌組和微膠囊組顯著提高肉雞盲腸乳酸桿菌數(shù)量(P<0.05)，同時(shí)微膠囊組還顯著降低肉雞盲腸沙門氏菌數(shù)量(P<0.05)。在42 d時(shí)相比于對(duì)照組，微膠囊組顯著提高肉雞盲腸乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，降低大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量(P<0.05)。

表3 微膠囊益生菌對(duì)肉雞盲腸微生物組成的影響

3 討論

為了驗(yàn)證內(nèi)源乳化凝膠法制備嗜酸乳酸桿菌微膠囊的活體使用效果，本試驗(yàn)研究了其對(duì)肉雞生產(chǎn)性能、免疫器官指數(shù)、免疫球蛋白水平和盲腸微生物的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)微膠囊化的唾液乳桿菌能夠顯著提高肉雞生產(chǎn)性能。李龍等(2019)[8]研究發(fā)現(xiàn)用冷凍干燥法制備的微降囊化植物乳酸桿菌能夠提高肉雞生產(chǎn)性能，Zhang等(2015)[9]同樣發(fā)現(xiàn)用內(nèi)源乳化法包埋的布拉酵母菌能夠顯著提高肉雞生產(chǎn)性能。但不同的微膠囊制備方法不同，包埋率、包埋顆粒大小等因素都會(huì)影響到微膠囊的使用效果，因此可能出現(xiàn)同樣的菌株利用不同的包埋方法產(chǎn)生不同的使用效果。

免疫器官指數(shù)和免疫球蛋白水平是評(píng)價(jià)肉雞免疫水平的一個(gè)重要指標(biāo)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)膠囊化和未膠囊化的益生菌均能提高肉雞的免疫器官指數(shù)和免疫球蛋白水平，但膠囊化益生菌效果更佳。這也就說明微膠囊化益生菌能夠進(jìn)一步提高益生菌的免疫增強(qiáng)作用。

外源微生物在進(jìn)入動(dòng)物腸道后在酸性和多種酶的環(huán)境作用下可能失活[2]。筆者試驗(yàn)結(jié)果顯示微膠囊益生菌能夠提高21 d和42 d肉盲腸中有益菌數(shù)量，而微膠囊化益生菌僅在21 d時(shí)能夠提高盲腸乳酸桿菌數(shù)量。這可能是有在肉雞飼養(yǎng)前期肉雞消化功能還不完善，益生菌更容易附著在腸道，而在生長(zhǎng)后期隨著消化機(jī)能完善造成益生菌很難在腸道增殖和存活，而在這個(gè)期間微膠囊化益生菌的保護(hù)作用就更佳明顯，從而造成微膠囊化益生菌在42 d時(shí)在改善腸道微生態(tài)上仍然有良好的使用效果。