雙價RNA干擾載體轉基因水稻抗飛虱研究

楊 穎，王愛娜

(渭南職業技術學院，陜西 渭南 714026)

通過導入Bt基因獲得轉基因抗蟲植株，已在棉花、番茄、油菜、玉米等作物上獲得成功,并且有的通過商業化釋放，在農業生產方面產生良好的經濟和生態效益。目前，從微生物、植物和動物來源的抗性基因已被成功用于轉基因研究的候選基因，在轉基因作物抗蟲研究應用方面，不同類型的蘇云金芽孢桿菌內毒素編碼基因Cry已被廣泛用于不同作物對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目或者膜翅目的昆蟲的抗性[1]。然而，昆蟲對殺蟲毒素迅速進化產生的抗性，使毒素對害蟲的無效性，對非靶向生物和微環境的影響是現有轉基因抗蟲方法的主要缺陷[2]。考慮到目前作物保護現狀，有必要探索出一種更加經濟、環境友好型的害蟲防治方法，因此利用植物介導的RNAi方法來抵抗褐飛虱有著潛在的價值[3]。

為利用RNAi技術培育抗褐飛虱水稻，我們先前采用重組PCR將已克隆獲得的褐飛虱V-ATPase D亞基基因片段和V-ATPase H亞基基因片段進行融合，融合基因V-ATPase D-H (VAD-H)以反向重復的方式連入改造后的pUCm-T，通過體外轉錄dsRNA飼喂褐飛虱若蟲致其死亡率增加[4]，為進一步驗證體外穩定表達dsRNA的轉基因植株在抗飛虱方面的作用，本研究通過將hp(VAD-H)定向插入到攜帶有篩選標記抗草丁膦bar基因的雙元表達載體pCAMBIA-1300上，從而產生發夾樣pcambia1300-Ubi-hp(VAD-H)-RNAi植物表達載體，經轉化獲得轉基因植物，飛虱取食轉基因植株后對其生長發育進行測定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 試驗所用褐飛虱由本校植物抗逆研究中心提供，在光照培養箱內(溫度25±2℃，相對濕度60%～70%，15 h光照/9 h黑暗)利用水稻幼苗進行飼養繁育。

1.1.2 主要試劑 本試驗所用大腸桿菌(E.coli)菌株，已構建載體pUCm-hp(VAD-H)來自本實驗室。引物由擎科生物合成，植物RNA提取試劑盒購自康為世紀，PrimeSTAR HS DNA Polymerase、內切酶和T4 ligase購自Takara公司，cDNA合成和qPCR試劑盒均購自全式金公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物雙元載體pCAMBIA1300-hp(VAD-H)的構建及水稻轉化 已獲取的含有發夾結構的重組載體pUCm-hp(VAD-H)，利用pUCm-T載體上帶有的酶切位點HindⅢ和Sac I雙酶切pUCm-hp(VAD-H)，將發夾結構插入經改造攜帶有篩選標記抗草丁膦bar基因的雙元表達載體pCAMBIA-1300，從而產生發夾樣pcambia1300-Ubi-hp(VAD-H)-RNAi植物表達載體，該載體中目的干擾基因由Ubi啟動子驅動，選擇標記bar基因由組成型35s啟動子驅動。載體經農桿菌介導轉化TN1水稻植株。轉化植株采用草丁膦進行篩選，篩選植株在溫室內進行培養。

1.2.2 轉基因水稻飼喂褐飛虱 通過噴施除草劑篩選抗性植株到T3代水稻幼苗進行生測，選取長勢一致的4葉期陽性轉化植株及非轉化植株(對照)轉移到生測裝置內，每個水培杯內種一株，植株根上部用塑料圓盤固定，并罩有一端扎有密孔尼龍網的透明塑料圓柱體，每個植株上放置10只12h內孵化的初孵1齡若蟲，每天記錄飛虱的數量和齡期，持續12 d，該試驗重復10次，試驗結束后收集飛虱，放置-80℃再進行后續實驗。生測實驗在人工氣候室內進行，溫度25±2℃，相對濕度60%～70%，15 h光照/9 h黑暗。

1.2.3 實時定量RT-PCR檢測 用康為世紀的植物RNA提取試劑盒(DNase I)提取總RNA，經反轉錄試劑盒合成cDNA。cDNA稀釋后作為模板，進行qRT-PCR，所用引物如表1所示。反應體系為20μL：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Forward Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，cDNA模板(20 ng·μL-1)1μL，ddH2O 8.2 μL。qPCR反應程序為：94℃ 30 s；94℃5 s，60℃30 s，40個循環。ABI Prism 7300為實時定量儀器，飛虱β-actin基因(GenBank：EUl79846)作為內參，基因相對表迖量計算采用Livak和Schmittgen[5]的方法。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 dsRNA轉基因水稻獲取及鑒定

將構建的含有篩選標記抗草丁膦bar基因的dsRNA干擾表達載體1300-Ubi-hp(VAD-H)-RNAi，通過農桿菌介導轉化TN1水稻愈傷組織，采用草丁膦進行篩選，進而獲取轉基因水稻植株。在溫室內培養，T0代轉化植株收獲的種子(T1)播種待幼苗長至三葉期時噴施草丁膦，選取除草劑抗性植株(T1)收獲種子(T2)，繼續種植篩選抗性植株到T3代，單株種植選取抗性不分離株系即為純合體，從抗草丁膦的陽性轉化植株和對照TN1植株中分別提取基因組DNA，用特異引物GTF1和GTR1擴增除草劑基因進行PCR檢測，結果如圖2a中可見所選取植株均為陽性轉化植株，隨后對植株進行除草劑基因的表達量檢測，如圖2b我們選取A3和A6兩個植株進行后續試驗。

2.2 體外喂食轉基因水稻后對飛虱影響

2.2.1 取食轉基因水稻對飛虱生長發育影響 為探究體外穩定表達dsRNA的轉基因植株對飛虱發育水平的影響，我們選取T3代植株A3和A6，待其長到四葉期幼苗用以喂食褐飛虱。體外飼喂試驗所用褐飛虱為TN1水稻上的初孵幼蟲，隨后將飛虱接種到轉基因水稻A3和A6 植株上，褐飛虱取食VAD-H轉基因水稻后，如圖3所示該轉基因水稻對褐飛虱1齡若蟲的發育歷期影響明顯，差異顯著外，對其他齡期若蟲發育歷期影響無明顯變化(圖3)。同時褐飛虱若蟲總發育歷期，相比對照明顯延長。

我們對飛虱成蟲存活壽命，世代周期同時進行了測定。取食轉基因水稻后，短翅型雌蟲壽命受到影響，與對照組相比較差異顯著，而對于短翅和長翅型雄性成蟲的壽命無顯著影響，此外，飛虱的世代周期相較于對照也明顯延長(圖4)。

圖2 轉化植株的檢測

(a)T3代轉化植株PCR檢測。M，DL2000 marker；1，ck；2-7，不同轉化植株；

(b)T3代轉化植株的qRT-PCR。A1-A6，不同轉化植株。

2.2.2 取食轉基因水稻對飛虱靶基因影響 為檢測飛虱取食轉基因植株后對其體內靶標mRNA的影響，利用熒光定量PCR對靶標基因的轉錄水平進行測定，試驗所用的3齡褐飛虱起初在TN1水稻上進行飼喂，隨后轉移到轉基因水稻A3及A6上持續飼喂4～8 d。對飼喂非轉基因TN1和轉基因水稻幼苗的褐飛虱分別抽提RNA，反轉錄后檢測褐飛虱體內靶基因的相對表達量。

褐飛虱取食VAD-H轉基因水稻，靶基因VATPase H的轉錄水平開始降低，A3和A6植株飼喂的飛虱其靶基因轉錄水平在第八天分別降低20.4%和28.6%(圖5A)。

同時靶基因V-ATPase D的轉錄水平也顯著降低，A3和A6植株上飛虱該基因轉錄水平在第八天分別降低了40.3%和43.5%(圖5B)。

3 討論

獲得在植物體內穩定表達昆蟲基因dsRNA的轉基因植物，成功介導昆蟲體內RNAi效應，使其靶基因被沉默甚至正常生理活動受到一定影響，對于減輕農作物蟲害具有潛在的應用價值。Baum等利用表達玉米根葉甲VATPase基因dsRNA的轉基因玉米，飼喂玉米根葉甲幼蟲，幼蟲出現發育受阻或死亡現象[6]。作為影響水稻生產的主要害蟲褐飛虱，其通過刺吸式口器，吸食植株維管束韌皮部汁液內的自由氨基酸和氨基類化合物，對水稻造成嚴重的生理損害。Zha等[7]選取了在褐飛虱中腸內高表達并且參與糖轉運的三個基因即NlHT1、Nlcar和Nltry，構建并轉化獲得表達上述基因dsRNA的轉基因植株，褐飛虱取食轉基因水稻后其體內對應基因的表達量下降了40%～70%。

我們先前克隆了飛虱V-ATPase D和V-ATPase H亞基基因片段，利用重組PCR獲得融合基因VAD-H，通過體外轉錄dsRNA飼喂褐飛虱并引起飛虱死亡率增加，在此基礎上構建了針對該融合基因的RNAi植物表達載體，獲取體外穩定表達dsRNA的純合株系，進一步檢測轉基因植物對飛虱生理水平的影響。當褐飛虱的初孵幼蟲接種到轉基因植株上，取食VAD-H轉基因水稻后，其1齡若蟲的發育歷期有所延長，而且飛虱若蟲總發育歷期，相比對照也明顯延長(圖3)。此外我們對取食dsRNA的褐飛虱靶基因轉錄水平，進行熒光定量PCR，結果表明飛虱體內靶基因表達水平均發生不同程度降低，并且降低水平隨飼喂時間延長顯著性下降(圖5)。表明攝入表達融合基因dsRNA的轉基因植物，能夠引發褐飛虱體內RNAi效應。

Li等研究在轉基因水稻表達產生高濃度dsRNA時才能引發高效率的環境性RNAi，并且可以阻礙褐飛虱的生長發育甚至能夠導致褐飛虱死亡[8]，因此當外界不能持續提供dsRNA時，干擾效果會受到限制。筆者研究中飛虱取食轉基因水稻后盡管生長發育相比對照受到一定的影響，但沒有出現明顯的致死表型，出現上述問題可能由于飛虱攝取dsRNA的量不足，或實驗體系不能引發RNAi強穿透能力，使得飛虱未出現死亡。因此在利用RNAi技術培育轉基因抗蟲植物時，需注意包括基因類型，基因片段大小，表達載體選擇等影響干擾效率的因素，從而充分發揮其干擾效應在害蟲防治方面的作用[7]。