結、直腸惡性腫瘤中SOX30基因的甲基化狀態及臨床意義

李超，孫艷華

（河北省滄州市人民醫院，河北 滄州）

0 引言

結、直腸惡性腫瘤，在醫院中比較常見，它一種消化道腫瘤。有研究發現，在全球惡性腫瘤的發病率中，結、直腸惡性腫瘤名列前三。在人群中有相對較高的發病率，對人們的生命健康造成極大的危害，且近年來，其發病率呈現出逐年增長的趨勢[1]。隨著臨床上對結、直腸惡性腫瘤研究的逐漸加深，發現結、直腸惡性腫瘤的發病機制之一就是表觀遺傳學。在該學說中，DNA甲基化為上述機制之一，腫瘤的發生于基因的異常表達緊密相關[2]。近期研究發現，SOX30基因是受甲基化調控的新腫瘤抑制基因，在腫瘤的發生中，SOX30基因能通過調控一系列與細胞凋零、增殖的相關信號通路而參與其中，有研究發現，肺癌的發生也與SOX30基因的失活密切相關[3]。為了進一步明確SOX30在其他腫瘤的發生中的參與情況，本研究就結直腸癌細胞中SOX30基因的甲基化狀態進行分析探究，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料與方法

選取我院于2018年12月至2019年12月整理的結直腸癌組織石蠟標本60例及12例癌旁組織進行分析，這些標本的采集均來自于于我院進行大腸癌切除術的大腸癌組織標本，同時切除了12例癌組織旁5 cm以上的正常組織作為癌旁組織標本。其中有男32例、女28例，年齡為34～65歲，平均為（48.58±5.48）歲。腫瘤分型如下：結腸鱗癌10例、結腸腺癌35例以及直腸腺癌15例。根據結腸癌TNM分期，有Ⅰ期13例、Ⅱ期40例以及Ⅲ期7例。

1.2 方法

對所有采集的標本進行逆轉錄PCR檢測、去甲基化實驗以及甲基化特異性PCR檢測以及BSP分析，具體方法如下。逆轉錄PCR檢測：采用Trizol法將3種結、直腸惡性腫瘤細胞株中的總RNA分別提取出來，取總數，共計2 μg，將提取出的RNA放入RT-PCR逆轉錄試劑盒中，反轉錄為cDNA，并取其模板1 μL，并分別將1 μL的SOX30基因上游引物與1 μL的下游引物、β-actin內參基因上游引物1 μL、與下游引物1 μL下加入其中，最后進行TaqDNA聚合酶擴增。去甲基化實驗：選取甲基化藥物5-氮雜-2-脫氧胞苷10 μmol/mL，將細胞進行處理，于實驗72 h后收集細胞，將總RNA提取出來，對細胞SOX30基因表達情況進行檢測。甲基化體異性PCR及硫化測序PCR：采用FFPE DNA Kit DNA提取試劑盒，將結、直腸惡性腫瘤組織細胞株DNA提出。采用EZ DNA Methylation Kit對提出的DNA加工修飾，于溫度為-20 ℃下進行保存。選1 μL硫化DNA樣本以及0.5 μL的甲基化上下游引物，同樣將TaqDNA聚合酶加入，進行MSP擴增。

1.3 觀察標準

根據標本的情況，對比不同年齡段（超過50歲以及低于50歲）、不同性別、不同腫瘤病理分型以及TNM分期的SOX30基因甲基化差異[4]。

1.4 統計學方法

兩組對比數據用SPSS 18.0軟件分析、處理，用（%）對計數數據進行表示，并用χ2檢驗，計量數據以（）表示，t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SOX30基因在結、直腸惡性腫瘤細胞株中的表達情況、甲基化情況以及mRNA表達情況

據研究結果，與對照組比較，可以發現在HCT116、HCT8Y、SW480惡性腫瘤細胞株中，SOX30基因調控的mRNA水平都表達較低。在上述細胞株中，SOX30的甲基化發生率較高，因此，高甲基化狀態與SOX30基因出現低表達情況具有相關性，在進行去甲基化實驗后，發現在以上3株細胞株中，明確存在SOX30基因調控的mRNA表達水平出現增強，說明在以上惡性腫瘤細胞株中，SOX30mRNA是甲基化的沉默基因。

2.2 人結直癌組織的甲基化情況

利用MSP法對60例結、直腸惡性腫瘤組織及12例腫瘤旁組織樣本進行檢測，觀察到60例結、直腸惡性腫瘤組織中，SOX30基因檢測出甲基化發生率為78.33%（47/60），在癌旁組織中為16.67%（2/12），表明在結、直腸惡性腫瘤組織中，出現SOX30甲基化的情況較多。

2.3 相關性分析

患者的年齡、性別、TNM分期與SOX30基因甲基化發生不存在內在相關性（P>0.05），同其所患惡性腫瘤的病理分型明顯相關，見表1。

表1 分析SOX30基因甲基化發生率相關性因素（n, %）

3 討論

SOX基因家族是由SRY相關基因所構成的一大類，編碼SOX的轉錄因子。這類基因除了決定性別、分化、參與早期發育，有研究發現，該基因對于腫瘤的發生作用重大[5]。隨著臨床上對SOX基因研究的不斷深入，發現其家族中一個基因，即SOX2，當其高表達時，發現患者的腫瘤浸潤深度相對較低，且其發生淋巴結轉移率也很低。當其在胃惡性腫瘤患者中高表達時，臨床觀察到其預后效果通常較好。此外，還有一些研究發現，在乳腺癌以及胰腺癌中，SOX17基因與SOX7基因均存在較高水平的甲基化率而出現失活，表明SOX基因與相關腫瘤的發生及發展中起到了十分重要的作用[6]。在1999年SOX家族中迎來了新的一員。De Mrtino等人發現了SOX30基因?；谇拜厒兿绕诘囊恍┫嚓P研究。SOX30被證實為一種抑癌基因，它通過調控p53基因水平，起到誘導腫瘤細胞凋亡的作用，從而實現其重要抑癌功能，由此推測，該基因極有可能在腫瘤的發生發展中扮演了重要角色。

利用MSP法對60例結、直腸惡性腫瘤組織及12例腫瘤旁組織樣本進行檢測，發現60例結、直腸惡性腫瘤組織中SOX30基因檢測出甲基化發生率為78.33%（47/60），在癌旁組織中為16.67%（2/12），明顯比結、直腸惡性腫瘤組織的發生率低，提示在結直腸惡性腫瘤組織中，出現SOX30基因甲基化的情況較多。根據研究結果，與對照組比較，可以發現在HCT116、HCT8Y、SW480惡性腫瘤細胞株中，SOX30基因調控的mRNA水平都表達較低。在上述細胞株中，SOX30的甲基化發生率較高，因此，高甲基化狀態與SOX30基因出現低表達情況具有相關性，在進行去甲基化實驗后，發現在以上3株細胞株中，明確存在SOX30基因調控的mRNA表達水平出現增強，說明在以上惡性腫瘤細胞株中，SOX30mRNA是甲基化的沉默基因。在結、直腸惡性腫瘤中，該基因呈現出了抑癌基因的表現，但相關機制尚待進一步研究。

綜上所述，在結、直腸惡性腫瘤的演變過程中，SOX30基因通過高甲基化失活或下調，就會導致其抑癌基因作用失去，而參與結、直腸惡性腫瘤的發生。臨床上將SOX30基因的甲基化作為潛在結、直腸惡性腫瘤標志物，具有較高的臨床意義。