基于UPLC-QTOF-MS 技術(shù)的壓榨和浸出油茶籽油甘油酯組成比較分析

胡 謙，張九凱*，韓建勛，邢冉冉，劉 晗，陳 穎

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

油茶籽油，又名山茶油、茶樹油、茶油，是山茶屬（CamelliaL.）油茶樹種子經(jīng)加工制得，與橄欖油、椰子油、棕櫚油并列為世界四大木本植物油，在我國已有2 000多年的歷史。油茶籽油中脂肪酸的組成和比例，以及物理化學(xué)性質(zhì)，與橄欖油接近，被譽(yù)為“東方橄欖油”[1]。油茶籽油富含單不飽和脂肪酸、茶多酚、角鯊烯和維生素，具有預(yù)防心腦血管疾病、抗腫瘤和抗氧化等功效[2-4]。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對生活質(zhì)量要求的提高，油茶籽油作為我國能與進(jìn)口橄欖油相媲美的木本食用油，其產(chǎn)量與銷量逐步上升。

油茶籽油的生產(chǎn)工藝主要有壓榨法和浸出法。壓榨法是利用物理壓力從山茶籽中將油脂榨取出來，出油率相比于浸出法要低。浸出法是采用食品級溶劑從壓榨后的山茶籽中浸出殘留的油脂，以提高出油率。市場上壓榨油茶籽油的價格和品質(zhì)都比浸出油茶籽油高[5-6]。由于國內(nèi)油茶籽油市場的消費量日漸遞增以及原料產(chǎn)量的限制等原因，導(dǎo)致了將浸出油茶籽油冒充壓榨油茶籽油出售以賺取巨額利潤的違法現(xiàn)象時有發(fā)生。GB 11765—2018《油茶籽油》中規(guī)定在外包裝上應(yīng)標(biāo)識油茶籽油的加工工藝，但目前還沒有有效的手段鑒別壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油。因此為了防止浸出油茶籽油冒充壓榨油茶籽油，保證消費者利益，為行政執(zhí)法提供依據(jù)，維護(hù)油茶籽油產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，開展研究浸出油茶籽油和壓榨油茶籽油的鑒別方法具有重要意義。

近年來，已經(jīng)有使用紅外光譜[7]、可見-近紅外光譜[8-9]、可見-紫外光譜[10]、核磁共振[11]等技術(shù)用于鑒別壓榨和浸出植物油。這些方法具有快速簡便的特點，但是難以從分子水平分析代謝物組成。植物油的主要成分是甘油三酯，占比達(dá)95%～98%[12-13]。脂質(zhì)組學(xué)是代謝組學(xué)最主要的分支之一，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品脂質(zhì)成分分析[14-15]、品質(zhì)判別[16-17]、真?zhèn)舞b別[18-19]和產(chǎn)地溯源[20-21]等方面。Jergovi?等[22]采用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)分析甘油三酯，可快速鑒別初榨橄欖油、精制橄欖油和葵花籽油摻假特級初榨橄欖油。Da Silveira等[13]基于質(zhì)譜技術(shù)篩選大豆油的特征脂質(zhì)，可鑒別低至1%的大豆油摻假的特級初榨橄欖油，此外Fasciotti等[23]使用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）建模可鑒別大豆油摻假特級初榨橄欖油。但目前還沒有基于液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)方法用于比較壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油的甘油酯組成。因此，本研究基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)，比較浸出油茶籽油和壓榨油茶籽油的甘油酯組成。結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析，以甘油酯分子組成為變量參數(shù)，建立判別模型以區(qū)分壓榨和浸出油茶籽油。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 種浸出油茶籽油和9 種壓榨油茶籽油均由江西省贛州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所提供，避光貯藏于室溫。異丙醇、乙腈、甲醇（均為質(zhì)譜級） 美國Honeywell公司；乙酸銨（質(zhì)譜級） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kinetex C18柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm，100 ?）美國Phenomenex公司；TripleTOF 6600質(zhì)譜儀（配備有2 個ExionLC AD泵、ExionLC AD自動進(jìn)樣器和ExionLC AC柱溫箱的ExionLC AD系統(tǒng)） 美國AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

每個樣品精確稱取0.1 g（±0.1 mg）溶解于10 mL甲醇-異丙醇（1∶1，V/V，5 mmol/L乙酸銨），稀釋10 倍，實驗樣品制備完成后，每個樣品取等量混勻作為質(zhì)控樣品，以監(jiān)測儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性，并優(yōu)化UPLCQTOF-MS條件。

1.3.2 脂質(zhì)分離與檢測

脂質(zhì)分離采用ExionLC AD系統(tǒng)，色譜柱為Kinetex C18柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm，100 ?）。二元梯度洗脫，流動相A為甲醇-乙腈-水（1∶1∶3，V/V，5 mmol/L乙酸銨），流動相B為異丙醇（5 mmol/L乙酸銨）。梯度洗脫程序為：0.0～1.0 min，80% A，20% B；1.0～3.0 min，80%～30% A，20%～70% B；3.0 ～1 3.0 m i n，3 0%～2% A，7 0%～9 8% B；13.0～15.0 min，2% A，98% B；15.0～15.1 min，2%～80% A，98%～20% B；15.1～18.0 min，80% A，20% B。流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，1 μL進(jìn)樣，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3 次。

使用串聯(lián)QTOF質(zhì)譜進(jìn)行質(zhì)譜檢測，配備有DuoSpray離子源，采用正離子模式。數(shù)據(jù)采集使用Analyst TF 1.7.1軟件，并在full-scan TOF MS和MS/MS模式下操作，在單針注射中采用信息依賴采集（information dependent acquisition，IDA）模式、動態(tài)背景扣除和實時多重質(zhì)量虧損。最佳離子源參數(shù)如下：離子源溫度550 ℃；噴霧電壓5 500 V；氣簾氣30 psi；霧化氣50 psi；輔助加熱氣55 psi；去簇電壓80 V。在全掃描TOF MS中，滯留時間為250 ms，質(zhì)量掃描范圍m/z200～1 200。在MS/MS模式下，碰撞能量35 eV；擴(kuò)展碰撞能量15 eV；滯留時間50 ms；質(zhì)量掃描范圍m/z150～1 200。此外，為了維持TripleTOF 6600在數(shù)據(jù)采集中保持高質(zhì)量準(zhǔn)確度，每隔6 個實驗樣品，使用自動校準(zhǔn)裝置系統(tǒng)對儀器進(jìn)行校正。

1.3.3 脂質(zhì)的鑒定

采取full-scan TOF MS和MS/MS模式掃描獲得精確的MS和MS/MS信息，使用PeakView 2.2軟件（美國AB Sciex）結(jié)合LIPIDMAPS[24]數(shù)據(jù)庫，對甘油三酯和甘油二酯定性分析。采用PeakView軟件鑒定脂質(zhì)，將各脂質(zhì)的分子式、離子加合方式輸入到MasterView插件中，軟件會算出一級精確質(zhì)量數(shù)，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)和同位素類型的誤差情況計算出樣品中該化合物的質(zhì)譜信息，并能匹配出液相色譜的出峰時間及豐度。質(zhì)量誤差范圍設(shè)置為0.02 Da，保留時間窗口設(shè)置為0.4 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每種脂質(zhì)的峰面積除以樣品中所有脂質(zhì)峰面積的總和，歸一化脂質(zhì)豐度數(shù)據(jù)。使用SIMCA 15.0（瑞典Umetrics）軟件進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)分析，采用佩爾托標(biāo)度（Pareto scaling）的PCA和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，

OPLS-DA）建立模型。通過使用SIMCA軟件的默認(rèn)選項對數(shù)據(jù)進(jìn)行七輪內(nèi)部交叉驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘油酯的定性分析

采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)，對油茶籽油中脂質(zhì)進(jìn)行分析。以full-scan TOF MS掃描以盡可能多檢測脂質(zhì)，并且采用MS/MS模式得到脂質(zhì)的二級質(zhì)譜信息。甘油酯在反相液相色譜上的洗脫依據(jù)等效碳數(shù)（等效碳數(shù)=脂肪酰基總碳數(shù)-2雙鍵數(shù)）的大小，等效碳數(shù)越大，保留時間也就越長[25]。植物油中脂質(zhì)主要為甘油三酯和甘油二酯，其主要的離子加合方式有3 種：[M+NH4]+、[M+Na]+和[M+H]+。為增強(qiáng)質(zhì)譜信號，在流動相和溶解試劑中添加改性劑乙酸銨。在電噴霧離子源模式下甘油酯以[M+NH4]+加合的質(zhì)譜響應(yīng)最強(qiáng)，因此以[M+NH4]+對UPLC-QTOF-MS數(shù)據(jù)提取甘油酯。二級譜圖可以確定甘油酯的脂肪酰基鏈組成，在碰撞池內(nèi)，前體離子[M+NH4]+離子會產(chǎn)生碎片離子[M-FA+H]+，即中性丟失FA+NH3[26]。因此可以基于中性丟失的質(zhì)量數(shù)，推測甘油酯的脂肪酰基鏈組成，結(jié)果見表1。在浸出和壓榨油茶籽油中均鑒定到43 種甘油三酯和12 種甘油二酯，UPLC-QTOF-MS分析油茶籽油的甘油酯組成見表2。

表1 甘油酯離子[MNH4]的脂肪酰基鏈中性丟失質(zhì)量數(shù)Table 1 Neutral loss masses of fatty acyl chains of glyceride ion[MNH4]+

表1 甘油酯離子[MNH4]的脂肪酰基鏈中性丟失質(zhì)量數(shù)Table 1 Neutral loss masses of fatty acyl chains of glyceride ion[MNH4]+

注：CN∶DB為酰基碳數(shù)∶雙鍵數(shù)。表2同。

名稱 CN∶DB 分子式 中性丟失質(zhì)量數(shù)乙酸 2∶0 C2H4O2 77.0辛酸 8∶0 C8H16O2 161.1月桂酸 12∶0 C12H24O2 217.2肉豆蔻酸 14∶0 C14H28O2 245.2肉豆蔻油酸 14∶1 C14H26O2 243.2棕櫚酸 16∶0 C16H32O2 273.3棕櫚油酸 16∶1 C16H30O2 271.3十六碳二烯酸 16∶2 C16H28O2 269.2十六碳三烯酸 16∶3 C16H26O2 267.2硬脂酸 18∶0 C18H36O2 301.3油酸 18∶1 C18H34O2 299.3亞油酸 18∶2 C18H32O2 297.3亞麻酸 18∶3 C18H30O2 295.3花生酸 20∶0 C20H40O2 329.3二十碳烯酸 20∶1 C20H38O2 327.3二十碳二烯酸 20∶2 C20H36O2 325.3山崳酸 22∶0 C22H44O2 357.4芥酸 22∶1 C22H42O2 355.3二十四烷酸 24∶0 C24H48O2 385.4二十四碳烯酸 24∶1 C24H46O2 383.4二十六烷酸 26∶0 C26H52O2 413.4二十六碳烯酸 26∶1 C26H50O2 411.4

表2 UPLC-QTOF-MS分析油茶籽油的甘油酯組成Table 2 Glyceride composition of camellia oil analyzed by UPLC-QTOF-MS

續(xù)表2

2.2 甘油酯的相對含量

在壓榨和浸出油茶籽油中均檢測到55 種甘油酯分子，未觀察到壓榨和浸出油茶籽油中甘油酯分子組成的明顯差異。同一類脂質(zhì)之間的質(zhì)譜離子化和質(zhì)譜響應(yīng)具有相似性和可比性，因此甘油酯分子的峰面積可代表其在食用油的含量。通過PeakView 2.2軟件的MasterView插件提取每個甘油酯分子的峰面積，并計算甘油酯的相對含量，進(jìn)一步比較壓榨和浸出油茶籽油中甘油酯分子相對含量的差異。

在本實驗中觀察到無論是壓榨油茶籽油還是浸出油茶籽油，甘油三酯都是主要成分，相對含量遠(yuǎn)高于甘油二脂。相比于浸出油茶籽油，壓榨油茶籽油中甘油三酯的相對含量更高，而甘油二酯的相對含量較低。壓榨和浸出油茶籽油中甘油三酯的相對含量存在極顯著差異（P＜0.01），分別為（98.58±0.45）%和（97.94±0.45）%，甘油二酯的相對含量存在極顯著差異（P＜0.01），分別為（1.42±0.45）%和（2.06±0.45）%。壓榨和浸出油茶籽油中最主要的5 種甘油酯相同，依次為TAG 54∶3、TAG 52∶2、TAG 54∶4、TAG 52∶3和TAG 54∶2，這些甘油酯的脂肪酰基鏈都有1～3 條是油酸（C18∶1）。而且脂肪酰基鏈均為油酸的TAG 54∶3是壓榨和浸出油茶籽油中最主要的甘油酯，相對含量均超過了30%，壓榨和浸出的相對含量差異不顯著（P＞0.05）。據(jù)報道油茶籽油中的油酸占總脂肪酸含量的74%～87%[27]，本實驗從甘油酯的脂肪酰基鏈組成出發(fā)，解析了油茶籽油中油酸在甘油酯上的分布。

2.3 甘油酯的化學(xué)計量學(xué)分析

使用UPLC-QTOF-MS技術(shù)鑒定到55 種甘油酯，需要對多維的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行降維分析，建立判別模型對壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油進(jìn)行鑒別。不同變量之間往往具有非常大的差異，因此為調(diào)整相關(guān)變量的權(quán)重，使用Pareto scaling對數(shù)據(jù)進(jìn)行縮放。佩爾托標(biāo)度是先將數(shù)據(jù)中心化處理后，以數(shù)據(jù)的方差平方根為縮放權(quán)重進(jìn)行縮放。R2X和R2Y分別代表矩陣X和矩陣Y的方差分?jǐn)?shù)。模型解釋度（R2）和預(yù)測度（Q2）的值越大（接近1），表明模型的解釋能力和預(yù)測能力越好[28]。一般要求，Q2大于0.9說明模型優(yōu)秀，Q2大于0.5說明模型比較好，R2和Q2值的差值不超過0.2～0.3[29]。

PCA模型是將原始的多維變量按一定權(quán)重組合產(chǎn)生新的主成分，PCA得分圖體現(xiàn)樣本之間的離散和聚集趨勢。首先將壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油的55 種甘油酯用于無監(jiān)督的PCA建模。依據(jù)甘油酯的組成，壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油在PCA模型的PC1和PC2上聚集成不同的2 類（圖1A），所有樣本都在95%的置信區(qū)間內(nèi)，R2X和Q2分別為0.964和0.861。所有質(zhì)控樣本在PCA得分圖上緊密聚集在一起，而且同一個樣本的3 個重復(fù)也緊密聚集在一起，說明數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。Hotelling'sT2和DMod未觀察到異常樣本。這些結(jié)果表明壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油的55 種甘油酯的組成差異，可以區(qū)分壓榨和浸出油茶籽油。

采用有監(jiān)督的OPLS-DA進(jìn)行判別分析，以最大程度地提高組間差異，突出關(guān)鍵變量和潛在標(biāo)志物。浸出油茶籽油和壓榨油茶籽油在OPLS-DA得分圖上聚集成2 類（圖1B）。OPLS-DA模型的R2X=0.643，R2Y=0.942，Q2=0.926，R2Y和Q2差值為0.016，表明模型的解釋能力和預(yù)測能力非常優(yōu)秀。由于本研究數(shù)據(jù)具有高維度和小樣本的特性，有監(jiān)督的判別模型容易出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象。因此為驗證模型的可靠性進(jìn)行置換檢驗（圖2），將X矩陣固定不變，隨機(jī)改變Y矩陣，重新建立OPLS-DA模型并計算R2和Q2。R2和Q2回歸線的斜率越大，與y軸的截距越小，最右端的OPLS-DA判別模型的R2和Q2值大于隨機(jī)改變Y矩陣計算的R2和Q2值（原始模型的解釋能力和預(yù)測能力大于隨機(jī)改變Y矩陣的模型），說明判別模型沒有過擬合[29]。OPLS-DA模型經(jīng)200 次置換檢驗，R2截距為0.132，Q2截距為-0.402，表明該模型擬合優(yōu)秀未出現(xiàn)過擬合，可以準(zhǔn)確預(yù)測壓榨和浸出油茶籽油。

圖1 壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油中55 種甘油酯的化學(xué)計量學(xué)分析Fig. 1 Chemometric analysis of 55 glycerides in pressed camellia oil and extracted camellia oil

圖2 壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油OPLS-DA判別模型的200 次置換檢驗結(jié)果Fig. 2 Results of 200 permutation tests of pressed camellia oil and extracted camellia oil with OPLS-DA

3 討論與結(jié)論

本研究采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)分離和檢測油茶籽油中的甘油酯，分析了壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油中脂質(zhì)的分子種類、脂肪酰基鏈組成、相對含量的差異，并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析建立區(qū)分壓榨和浸出油茶籽油的判別模型。共鑒定到55 種甘油酯分子，包括43 種甘油三酯和12 種甘油二酯。田瀟瀟等[30]采用高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)在15 個不同物種/品種油茶果實中檢測到24 種甘油三酯，此外Zeb等[31]在油茶籽油中檢測到15 種甘油三酯。而本研究發(fā)現(xiàn)了許多之前沒有在油茶籽油中報道過的甘油酯分子，說明UPLC-QTOF-MS技術(shù)結(jié)合IDA掃描具有更高的質(zhì)量精確度、靈敏度和寬的動態(tài)范圍，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)（m/z）和二級譜圖（MS/MS）有助于分析和鑒定更多的甘油酯分子，對區(qū)分浸出和壓榨油茶籽油提供大量甘油酯分子組成信息。通過分析甘油酯的脂肪酰基鏈組成，發(fā)現(xiàn)單個甘油酯分子（m/z相同的甘油酯）的脂肪酰基鏈存在多種可能的組成，以本研究的技術(shù)難以實現(xiàn)脂肪酰基鏈異構(gòu)的完全分離。例如依據(jù)二級質(zhì)譜圖的碎片離子峰推測甘油酯分子的脂肪酰基鏈組成，發(fā)現(xiàn)TAG 54∶4分子可能同時存在2 種脂肪酰基鏈組成：18∶0/18∶2/18∶2和18∶1/18∶1/18∶2。大白菜葉片的甘油酯分子也存在這一現(xiàn)象，鄭姝寧等[32]采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)在大白菜葉片中鑒定到甘油酯多達(dá)65 種，而且發(fā)現(xiàn)許多甘油酯分子的脂肪酰基鏈存在多種組成。甘油酯分子的脂肪酰基鏈位置、長度和不飽和度差異，以及雙鍵的順反異構(gòu)和脂肪酰基鏈位置異構(gòu)，使得甘油三酯的物理化學(xué)性質(zhì)多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且不同甘油酯分子的含量差異巨大，跨越幾個數(shù)量級。但這對開發(fā)具有更強(qiáng)分離能力的技術(shù)，以解析油茶籽油甘油酯異構(gòu)體的營養(yǎng)品質(zhì)和生物功能提供了理論依據(jù)。壓榨油茶籽油和浸出油茶籽油中最主要甘油酯的相對含量并沒有顯著差異，但結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析可以有效區(qū)分壓榨和浸出油茶籽油。

結(jié)果表明采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)分析方法，可快速和準(zhǔn)確地分析食用油甘油酯分子組成，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析建立多元統(tǒng)計學(xué)分析模型，為分析不同加工工藝油茶籽油的脂質(zhì)組成提供了強(qiáng)大的分析平臺，對維護(hù)油茶籽油產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、保障消費者權(quán)益提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。