姜黃素提高PC12細胞的抗氧化能力

肖寶平，陳 露，曾 珺，劉靜雯，李 健，李桂玲,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建 廈門 361021；3.福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

姜黃素是從姜科植物根莖中分離的一種天然多酚，是咖喱粉的重要成分，被世界衛生組織和聯合國糧食及農業組織列為食品添加劑，并且是被廣泛應用的天然活性物質之一[1]。作為一種食品添加劑，姜黃素還具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病等多種功能[2-4]。因副作用小、價格低且容易獲得，姜黃素在食品營養及醫藥方面的重要性逐漸凸顯，其抗氧化作用也成為近年來的研究熱點之一。

氧化應激是過氧化物和抗氧化劑之間的動態不穩定狀態，因分子氧自由基或活性氧（reactive oxygen species，ROS）及其代謝物增加或抗氧化機制減弱引起[5]。自由基清除速率減緩會引起細胞內ROS堆積或機體抗氧化能力減弱，氧化系統和抗氧化系統失衡，造成核酸、蛋白質和脂質等生物分子的損傷，進而可能導致心血管疾病、阿爾茨海默癥和帕金森病等多種慢性疾病的發生與發展[6-7]。有報道顯示，姜黃素能夠增加阿爾茨海默癥模型鼠的海馬神經元突觸數量，保護神經組織。Chandra等的流行病學研究表明，經常食用姜黃素的印度人患阿爾茨海默癥發病率比美國人要低得多[8]。姜黃素的抗氧化作用可能有兩種途徑：一是因其具有酚羥基結構，可作為ROS的清除劑，中和環境中多余的ROS；二是作為抗氧化信號的誘導劑，通過增強抗氧化酶活力，下調氧化蛋白和脂質自由基的水平，增強細胞的抗氧化防御系統[9-10]。姜黃素清除ROS的作用涉及多條信號轉導通路[11-12]，但具體的作用靶點仍有待進一步研究。

研究氧化應激和抗氧化作用的方法有化學實驗法、細胞模型法和動物模型法等，針對不同的研究目的，可選擇不同細胞模型、動物模型以及應激源作為研究對象[13]。本實驗以大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤（pheochromocytoma，PC12）細胞為模型探究姜黃素的抗氧化作用。PC12細胞是大鼠腎上腺髓質瘤經輻射衍生出的神經元前體細胞系[14]，具有易獲得、可傳代和快速增殖的特點，且有神經元的形態和生理功能；因此被廣泛用作神經細胞生理、病理及藥理相關研究的細胞模型[15-16]。PC12細胞存在未分化、低分化和高分化3 種分化類型。未分化的PC12細胞未生長出神經突起或形成神經突觸，但具有分化為神經元樣細胞的潛能，細胞形態呈圓形或多角形、易團聚，經神經生長因子誘導可轉為低分化或高分化PC12細胞；低分化PC12細胞貼壁性增強，表現為多邊形、初步形成突起；高分化PC12細胞形成明顯的突起，具備神經元的細胞形態。隨分化程度的提高，PC12細胞突起數量增加，并緊密連接交織成網絡，類神經特性增強，對藥物的敏感差異程度加劇[17-18]。眾多研究表明，PC12細胞是研究抗氧化作用的合適模型。近年來研究者們以PC12細胞為對象，通過H2O2或其他誘導劑建立氧化應激或各種神經退行性疾病細胞模型，探討氧化應激損傷及抗氧化劑的保護機制。李盡文等發現姜黃素對H2O2誘導PC12細胞的氧化應激損傷具有保護作用[19]。郭勇等利用PC12細胞研究長白山核桃源五肽對H2O2誘導的氧化損傷的保護作用及機理[20]。Bao Dengke等用PC12細胞研究槲皮素對氧化應激的影響[21]。

然而，上述研究均未指明PC12細胞的分化程度，也未涉及細胞的分化狀態與氧化應激的關系。食源性抗氧化劑對不同分化程度PC12細胞的抗氧化能力影響還有待研究。因此，本實驗分別以高分化、低分化PC12細胞為研究對象，探究姜黃素對不同分化狀態的PC12細胞抗氧化能力的影響及可能的機理，為其作為食源性抗氧化劑的開發應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低分化和高分化PC12細胞均購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

姜黃素 美國Sigma公司；RPMI-1640培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、雙抗美國Hyclone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）澳洲Gemini公司；胰蛋白酶、Optin-MEM無血清培養基美國Gibco公司；噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT） 南京奧多福尼生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Amresco公司；RNAiso Plus總RNA提取試劑盒、SYBR Premix ExTaqII熒光定量試劑盒 日本Takara公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）、ROS測定試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；GoScriptTMReverse Transcription System、RQ1 RNase-Free DNase 美國Promega公司。

1.2 儀器與設備

Forma 3111型CO2恒溫細胞培養箱 美國Thermo公司；SG-403生物安全柜 美國Baker公司；Synergy HIMF型多功能酶標儀 美國BioTek公司；MDF-u3386S超低溫冰箱 日本松下健康醫療器械有限公司；5810R高速冷凍離心機、Mastercycler nexus梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Eppendorf公司；ABI7300實時熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

采用體積分數為10% FBS和1%雙抗（青霉素、鏈霉素）的改良型1640完全培養基，在37 ℃、相對濕度5% CO2的細胞培養箱中連續培養。

1.3.2 細胞相對增殖率測定

采用MTT法測定姜黃素處理后PC12細胞的相對增殖率，確定姜黃素的作用濃度。取對數生長期細胞制成1×105個/mL單細胞懸液，每孔100 μL接種于96 孔板中，于培養箱中過夜培養后棄培養基，每孔加入100 μL不同質量濃度的姜黃素進行處理。以DMSO為陰性對照，并設置空白對照（不作任何處理）。繼續培養24 h后每孔加入100 μL質量濃度0.5 mg/mL的MTT培養基溶液，孵育4 h后加入150 μL DMSO，振蕩10 min，在多功能酶標儀上測定OD490nm，每個樣品至少做6 次重復。其中本底值記為OD0，空白對照記為OD1，實驗樣品記為OD2，樣品組細胞相對增殖率按下式計算。

1.3.3 細胞總抗氧化能力的測定

根據Roberta等的2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）法[22]和Benzie等的鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）法[23]測定細胞T-AOC。

ABTS法：ABTS在二硫酸鉀的作用下轉化成綠色的ABTS陽離子自由基，其在734 nm波長處有最大吸收。抗氧化劑會抑制ABTS向ABTS陽離子自由基的轉變，通過吸光度的測定可計算出樣品的ABTS陽離子自由基清除能力，以此表征T-AOC。

FRAP法：酸性條件下，抗氧化劑可以還原鐵三吡啶基三嗪絡合物（ferric-tripyridyltriazine，Fe3+-TPTZ）產生藍色的Fe2+-TPTZ，其在592 nm波長處有強吸收，通過吸光度的測定計算出樣品的FRAP，以此表征T-AOC。具體操作為：將對數生長期的細胞每孔接種約2×106個于6 孔板中，于培養箱中過夜培養后加入2 mL不同質量濃度的姜黃素培養基進行處理，以DMSO為對照，繼續培養24 h后收集細胞并提取總蛋白，然后按照ABTS法和FRAP法試劑盒說明書進行檢測。

1.3.4 活性氧水平的測定

根據Liu Mengxi等的DCFH-DA探針法[24]測定胞內ROS水平。即細胞用10 μmol/L的DCFH-DA探針原位標記30 min，后用無血清培養基清洗殘余探針，將細胞收集并重懸于無血清培養基中，使用酶標儀在激發波長488 nm、發射波長525 nm處測定熒光強度。

1.3.5 細胞抗氧化酶活力的測定

將對數生長期的細胞每孔接種約2×106個于6 孔板中，于培養箱中過夜培養后加入2 mL不同質量濃度的姜黃素培養基進行處理，以DMSO為對照，繼續培養24 h后收集細胞并提取總蛋白。

酶活力的測定分別按照SOD、CAT和GSH-Px試劑盒說明書進行操作。

1.3.6 細胞抗氧化酶基因表達水平的測定

采用實時熒光定量PCR法檢測細胞抗氧化酶基因表達水平。用RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，用GoScriptTMReverse Transcription System進行隨機引物反轉錄，最后用SYBR Premix ExTaqII試劑盒進行PCR檢測，實時熒光定量PCR引物序列見表1。采用2－ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量，其中ΔΔCt＝ΔCt（實驗樣品）－ΔCt（對照），ΔCt＝Ct（目的基因）－Ct（GAPDH）。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Sequences of primers used for real-time quantitative PCR

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 姜黃素對PC12細胞相對增殖率的影響

PC12細胞存在未分化、低分化和高分化3 種類型。未分化的PC12細胞未生長出神經突起，而分化的PC12細胞突起增加并緊密連接交織成網絡，更具神經元細胞的特性。如圖1所示，處理24 h后，姜黃素對不同分化程度PC12細胞相對增殖率的影響不同。低分化PC12細胞在姜黃素作用濃度小于20 μmol/L時，細胞相對增殖率沒有顯著性變化（P＞0.05）；濃度大于等于20 μmol/L時，細胞相對增殖率顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。而高分化P12細胞在姜黃素濃度為10 μmol/L時增殖受到一定抑制，但大部分細胞生長正常；濃度為20 μmol/L時，細胞相對增殖率下降約60%，大量細胞死亡。20 μmol/L的姜黃素對低分化PC12細胞、10 μmol/L的姜黃素對高分化PC12細胞增殖均有一定的抑制作用，細胞相對增殖率下降小于20%，大部分細胞生長正常，且細胞可能仍有一定的應激反應能力。因此，后續研究中，低分化PC12細胞的姜黃素作用濃度選擇5、10 μmol/L和20 μmol/L，高分化PC12細胞的姜黃素作用濃度選擇2.5、5 μmol/L和10 μmol/L。

圖1 不同濃度姜黃素對PC12細胞相對增殖率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of curcumin on the relative proliferation rate of PC12 cells

2.2 姜黃素對PC12細胞總抗氧化能力的影響

ABTS法檢測結果如圖2所示，經姜黃素處理24 h后，低分化PC12細胞的T-AOC隨姜黃素濃度的提高而顯著增強（P＜0.05）；而高分化PC12細胞在低濃度姜黃素作用后T-AOC變化不大，僅在10 μmol/L姜黃素處理后，胞內T-AOC才顯著提高約30%（P＜0.05）。

FRAP法檢測結果如圖3所示，經姜黃素處理24 h后，低分化PC12細胞的T-AOC增強，在20 μmol/L濃度下極顯著提高了約50%（P＜0.01）；而高分化PC12細胞僅在10 μmol/L姜黃素處理后，胞內的T-AOC極顯著提高了約25%（P＜0.01），這與ABTS法檢測結果類似。結果表明，不同分化類型的細胞對姜黃素的敏感度不同。雖然10 μmol/L姜黃素對高分化PC12細胞增殖有一定的抑制，但其均能顯著增強低、高分化PC12細胞的T-AOC（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 不同濃度姜黃素對PC12細胞T-AOC的影響（ABTS陽離子自由基清除能力）Fig.2 Effect of curcumin at different concentrations on T-AOC (ABTS cation radical scavenging capacity) of PC12 cells

圖3 不同濃度姜黃素對PC12細胞T-AOC的影響（FRAP）Fig.3 Effect of curcumin at different concentrations on T-AOC (FRAP) of PC12 cells

2.3 姜黃素對PC12細胞活性氧水平的影響

細胞內ROS堆積，可能使氧化系統和抗氧化系統失衡并產生氧化應激。如圖4所示，低分化細胞經5 μmol/L及10 μmol/L姜黃素處理24 h后，胞內ROS水平均極顯著下調了約30%（P＜0.01），經20 μmol/L姜黃素處理后熒光強度極顯著下降了約50%（P＜0.01）；高分化細胞經5 μmol/L和10 μmol/L姜黃素處理后，ROS水平分別極顯著下調了約20%和40%（P＜0.01），且ROS下調水平與姜黃素濃度成正比。

圖4 不同濃度姜黃素對PC12細胞ROS水平的影響Fig.4 Effect of curcumin at different concentrations on ROS level in PC12 cells

2.4 姜黃素對PC12細胞抗氧化酶活力的影響

圖5 不同濃度姜黃素對PC12細胞抗氧化酶活力的影響Fig.5 Effect of curcumin at different concentrations on antioxidant enzyme activities in PC12 cells

姜黃素可通過激活細胞內的抗氧化防御系統來清除過量的ROS。細胞主要抗氧化物酶（SOD、CAT和GSH-Px）的活力可作為研究機體自由基清除能力的有效指標。如圖5所示，低分化P12細胞經姜黃素處理24 h后，SOD相對活力顯著上升（P＜0.05），且酶活力變化與姜黃素濃度成正比，而CAT和GSH-Px活力僅在高濃度姜黃素（20 μmol/L）作用下顯著上升（P＜0.05）；高分化PC12細胞中，3 種酶的活力僅在10 μmol/L姜黃素作用下顯著上升（P＜0.05，P＜0.01），低濃度姜黃素對酶的活力基本沒有影響（P＞0.05）。因此，一定濃度的姜黃素能提高PC12細胞SOD、CAT和GSH-Px的活力，但它對不同抗氧化酶的作用有差異，且不同分化程度細胞對姜黃素的敏感度也不同。

2.5 姜黃素對PC12細胞抗氧化酶基因表達水平的影響

圖6 不同濃度姜黃素對PC12細胞抗氧化酶基因表達水平的影響Fig.6 Effect of curcumin at different concentrations on antioxidant enzyme gene expression level in PC12 cells

如圖6所示，經姜黃素處理24 h后，低分化、高分化P12細胞內3 種抗氧化酶基因SOD-2、CAT、GPX-1的mRNA相對表達水平上調。特別是在高濃度姜黃素作用下（低分化細胞20 μmol/L、高分化細胞10 μmol/L），低分化細胞內CAT的mRNA表達水平極顯著上調了約1 倍（P＜0.01）；而高分化細胞內抗氧化酶基因表達水平上調更為顯著。這一結果與抗氧化酶活力上升的趨勢一致。結果發現，姜黃素不僅可以提高抗氧化酶的活力，還可以上調抗氧化酶的表達水平。

3 討 論

ROS在生物系統中起著雙重作用。低水平的ROS能參與細胞存活信號的調節，高水平的ROS會破壞細胞結構引起氧化損傷甚至導致細胞凋亡，這往往是細胞氧化損傷的主要原因[25-26]。正常狀態下，機體中產生和清除ROS的速率處于動態平衡。當機體內自由基含量增加或抗氧化酶系統動力不足以清除多余的自由基時，這種動態平衡被打破，從而引發機體內的氧化應激[27]。氧化應激可能會削弱內源性抗氧化系統，增加細胞的氧化損傷，而抗氧化劑可降低細胞內ROS和氧化應激水平[28]。氧化應激的整體評估包括總氧化應激和T-AOC[29]，一個體系內的各種抗氧化大分子、小分子和酶的總水平反映該體系的T-AOC。因此，可通過檢測胞內T-AOC與ROS水平等評價抗氧化劑的作用效果。測定細胞、組織、血漿和其他各種體液中T-AOC的常用方法有ABTS法和FRAP法等。ABTS法通過測定被檢測物的ABTS陽離子自由基清除能力表征T-AOC；FRAP法通過測定被檢測物將Fe3+還原為Fe2+的能力表征T-AOC，ABTS法與FRAP法在結果上具有較好的相關性與一致性。本實驗結果發現，一定濃度的姜黃素能顯著提高低分化和高分化PC12細胞的ABTS陽離子自由基清除能力及FRAP，同時顯著降低細胞中ROS水平，且降低水平與姜黃素呈濃度依賴關系，說明姜黃素在PC12細胞中具有抗氧化功能。這與已報道的姜黃素清除ROS自由基、抑制脂質過氧化等的作用一致[30]。此外，鐘宇等發現姜黃素可通過清除ROS自由基，改善HT29細胞線粒體功能，對細胞氧化損傷起保護作用[31]。Fu Xiaoyan等研究發現，姜黃素可通過抑制ROS的過量產生，調節絲裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶B途徑，減弱由H2O2引起的PC12細胞半胱天冬酶激活、多聚ADP-核糖聚合酶裂解和線粒體功能障礙[32]。

PC12細胞是研究抗氧化作用很好的細胞模型。未分化PC12細胞具有分化為神經元樣細胞的潛能，對由各種物質引起的毒性較敏感，常用于研究物質的神經元毒性[33-34]；低分化PC12細胞貼壁性增強，突起初步形成；高分化PCI2細胞形成明顯的突起，具備神經元的細胞形態，常用于建立帕金森疾病和阿爾茨海默病模型[35-36]。本實驗結果顯示，姜黃素對不同分化類型PC12細胞有不同的影響。這可能與不同分化程度的PC12細胞反映慢性疾病的不同進展程度、對氧化應激的抵抗能力不同相關。高、低分化PC12細胞對姜黃素的敏感程度不同，高分化細胞更為敏感，如10 μmol/L姜黃素處理24 h后，低分化細胞相對增殖率沒有變化，高分化細胞雖然大部分形態正常，但增殖受到一定抑制；該濃度姜黃素處理后，高、低分化PC12細胞的T-AOC均顯著增強，ROS水平顯著下調。這可能是由于細胞在姜黃素作用初期增殖受到一定影響，但大部分細胞仍顯示正常狀態，隨后細胞的應激系統被激活，T-AOC增強。因此，一定濃度的姜黃素在PC12細胞中可發揮抗氧化特性。

細胞可通過內源性抗氧化系統調節抗氧化酶活力和抗氧化物濃度以抵消氧化損傷[37]。細胞內源性抗氧化系統分為酶抗氧化系統和非酶抗氧化系統：酶抗氧化系統主要包括SOD、CAT、GSH-Px、谷胱甘肽還原酶等；非酶抗氧化系統包括GSH、VC、尿酸等。姜黃素能通過調節抗氧化酶活力發揮其生物學功能。如歐海龍等發現喂食姜黃素的果蠅壽命發生不同程度的延長，這與SOD、CAT等酶活力增強有關，提示姜黃素可通過提高機體抗氧化酶活力延緩衰老[38]。而Yang Bobo等發現姜黃素可以緩解甲基汞誘導的原代大鼠星形膠質細胞的氧化應激和細胞損傷，且能夠使CAT和GSH-Px活力提高[39]。本實驗發現姜黃素在高濃度（低分化細胞20 μmol/L、高分化細胞10 μmol/L）下處理PC12細胞時抗氧化酶活力顯著提高，說明細胞內源性抗氧化酶系統得到增強，而此時細胞活力已下降，原因可能是高濃度姜黃素對細胞有一定刺激，導致細胞增殖受到抑制，并因此激活了細胞的抗氧化防御系統，使其自由基清除能力也相應增強。

線粒體是產生和消除ROS的主要場所，對于氧化應激的影響較敏感。線粒體中存在大量抗氧化酶，保護線粒體的氧化還原平衡，因此線粒體的功能與氧化應激密切相關[40]。基因表達調控是影響抗氧化酶的重要因素。SOD基因常與金屬離子結合，以SOD-1、SOD-2和SOD-33 種形式分別存在于細胞質、線粒體和細胞外，其中SOD-2編碼Mn-SOD，是線粒體的主要抗氧化酶基因[41]。CAT基因具有高效性，其基因的多態性與癌癥和代謝性疾病相關[42]。GPX基因有8 種類型，GPX-1編碼含量最豐富的硒氧化酶，幾乎存在于所有組織中，且具有多態性[43]。SOD-2、CAT和GPX-1均能編碼線粒體抗氧化酶。本實驗發現姜黃素能促進其表達，與其對這3 種酶活力的調節相似，說明姜黃素可能通過增強抗氧化酶活力，上調酶的表達來增強自由基清除能力，維持線粒體的氧化還原平衡，增強PC12細胞的抗氧化能力。

綜上，姜黃素可能通過增強胞內抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）活力及上調其基因的表達來增強PC12細胞的T-AOC，下調胞內ROS水平，促進細胞的氧化還原平衡。姜黃素可能通過改善線粒體的功能及激活細胞的抗氧化防御系統，對細胞起保護作用。此外，姜黃素對不同分化類型的PC12細胞有不同影響，提示其可能對不同進程的慢性疾病有不同的保護能力。姜黃素的生物活性及對線粒體的調節機制還有待進一步研究，如對線粒體膜電位、氧化磷酸化等功能的調節，以及對線粒體生物合成的影響。姜黃素抗氧化機制的解決將有助于其作為食源性抗氧化劑的開發應用，并為氧化應激相關疾病的預防與治療提供理論依據。