黃連對2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性及內質網應激相關蛋白表達的影響

詹玫琦， 周珊珊， 萬曉剛

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510450；2.湖北中醫藥大學，湖北武漢 430065；3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

肥胖已成為2 型糖尿病發病的危險因素之一。肥胖導致脂肪組織中脂肪含量增加、游離脂肪酸（NEFA）清除率降低，從而促使機體循環中的NEFA濃度升高[1]，長期高水平的NEFA在非脂肪組織（如胰腺、骨骼肌、肝臟）中對葡萄糖穩態的毒害作用被稱為脂毒性[2]。已有越來越多的研究表明，脂毒性參與2型糖尿病的發病機制，并與大血管相關的糖尿病并發癥（如冠心病、中風等）密切相關[3]。中藥黃連運用于治療糖尿病（消渴）已有1 400多年歷史[4]，既往臨床研究亦證明了黃連具有改善糖脂代謝紊亂的作用[5-6]。現代藥理研究報道，在中藥黃連中已發現100 多種有效成分[7]，其中，小檗堿[8-9]、黃連堿[10]、黃連多糖[11]等能通過多種信號通路改善2型糖尿病糖脂代謝紊亂，減輕糖毒性作用，但黃連對于脂毒性的作用機制尚不明確。為此，本研究通過建立高脂高糖飼料喂養聯合腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）建立2 型糖尿病大鼠模型，研究黃連對2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性的調控作用，并探討其相關內質網應激機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級健康雄性Wistar大鼠100只，體質量（140 ± 20）g，購于湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。飼養在湖北中醫藥大學SPF 級動物實驗室內，室溫為（25±3）℃，相對濕度為（55±5）℃，12 h 光照周期，自由進食飲水。本實驗獲得湖北中醫藥大學動物倫理委員會批準。

1.2藥物取黃連藥材2 kg（購于廣州中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，經萬曉剛教授鑒定為正品，產地四川，批號：160201），加8 倍蒸餾水浸泡時間達1 h，煎煮3 次，混勻后用旋蒸儀將煎煮物濃縮成膏狀，再將其冷凍為干燥粉末。1 g 黃連可提取0.23 g黃連藥粉，密封冷藏保存。鹽酸二甲雙胍片，購于中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：H20023370。

1.3試劑STZ（美國Sigma 公司）；NEFA、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、總低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；多聚甲醛、蘇木素染色液（武漢阿斯本生物技術有限公司）；活化轉錄因子4（ATF4）抗體、葡萄糖調節蛋白78（GRP78）抗體（上海艾博抗貿易有限公司）；C/EBP同源蛋白（CHOP）抗體（美國CST公司）。

1.4儀器JPS-5血糖儀和試紙（北京怡成生物電子技術股份有限公司）；DR-200Bs酶標儀（無錫華衛德朗儀器有限公司）；TGL16c 臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；TGL-16冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器）；計數儀（中國科技大學中佳科技實業有限公司）；JT-12K 脫水機、JB-P5 包埋機、JB-L5冷凍臺、JK-5攤片機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016 切片機（上海徠卡儀器有限公司）；DHG-9123A 烘干箱（上海一恒科學儀器有限公司）；CX-21 光學顯微鏡（深圳奧林巴斯工業有限公司）。

1.5造模、分組及給藥將100 只Wistar 大鼠隨機抽取20 只設為正常組，其余80 只設為造模組。正常組給予普通飼料喂養10 周。造模組給予高脂高糖飼料（其成分按質量分數配比：10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇、1%膽酸鹽、67%普通飼料）喂養10周后，禁食不禁水12 h，一次性給予大鼠腹腔注射STZ 30 mg/kg[12]。造模5 d后尾靜脈采血檢測空腹血糖（FBG），重復測定3次FBG ≥11.1 mmol/L的大鼠即判斷為糖尿病大鼠。成功造模大鼠共60 只。按血糖值隨機分為3 組，分別為模型組、黃連組和二甲雙胍組。分組后次日起所有大鼠稱質量后給藥。黃連組：根據《中藥藥理研究方法學》[13]及相應臨床研究用量總結[14]評估，60 kg 成人的黃連給藥用量為10 g/d，大鼠的用藥劑量等于標準體質量與人使用劑量相乘，經過前期預實驗研究探索，取預實驗的中劑量，即成人與大鼠的折算系數為10，按60 kg成人的每日用藥劑量計算得大鼠黃連粉灌胃劑量為0.4 g·kg-1·d-1；二甲雙胍組：劑量參照具有較好的降糖降脂作用的相應研究[15]，給予鹽酸二甲雙胍0.2 g·kg-1·d-1灌胃給藥；模型組和正常組：給予等體積蒸餾水灌胃。每日1 次，灌胃5 周。干預期間均采用普通飼料喂養，自由進食飲水。

1.6標本采集首次給藥前空腹12 h，尾靜脈采血測FBG。灌胃期間每周尾尖采血測一次FBG 并稱質量。5 周后，空腹12 h，20 g/L 戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動脈采血制備血清標本，靜置2 h，以3 000 r/min 離心15 min，所得血清用于測定血脂，剩余血清-80 ℃冰箱凍存待測。將大鼠仰臥固定，沿腹中線剪開，取出各組大鼠胰腺。

1.7血清生化指標檢測將離心所得血清采用全自動生化分析儀測定TC、TG、HDL-C、LDL-C、NEFA的濃度，操作方法同說明書。

1.8免疫組織化學法檢測大鼠胰腺CHOP、ATF4、GRP78蛋白的表達將胰腺組織切片進行脫蠟，置于四乙銨二乙酸鈉（EDTA）緩沖液中修復，后在室溫下放置于體積分數3%過氧化氫溶液避光孵育。用體積分數5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min。用一抗（CHOP 1∶50，ATF4 1∶50，GRP78 1∶300 稀釋）50 μL覆蓋組織4 ℃過夜。隔天給予相應的二抗50 ～100 μL 37 ℃覆蓋50 min。予50 ～100 μL新鮮配制的3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）溶液顯色，蘇木素復染，體積分數1%鹽酸酒精分化1 s，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，進行采圖。使用軟件Image-Pro Plus對光密度值進行分析。

1.9統計方法采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。先對計量資料進行正態分布檢驗，如符合正態分布，多樣本組間差異的分析方法選用單因素方差分析，進一步兩兩比較，數據方差齊者使用LSD法，方差不齊者釆用Dunnett’s T3法；若不符合正態分布，則采用非參數秩和檢驗Kruskal-Wallis 檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1各組大鼠灌胃前后體質量和FBG值的比較表1結果顯示：治療前，3 組糖尿病大鼠體質量均低于正常組（P＜0.05），FBG值均高于正常組（P＜0.05）。治療后，3組糖尿病大鼠體質量仍有不同程度的下降。與正常組比較，模型組大鼠體質量明顯下降，FBG 值明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，黃連組體質量上升，二甲雙胍組體質量下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），黃連組、二甲雙胍組FBG 值均下降（P＜0.05）。

表1 各組大鼠治療前后體質量、空腹血糖（FBG）值比較Table 1 Comparison of body mass and FBS value in various groups before and after treatment （±s）

表1 各組大鼠治療前后體質量、空腹血糖（FBG）值比較Table 1 Comparison of body mass and FBS value in various groups before and after treatment （±s）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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2. 2各組大鼠治療后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平的比較表2 結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C、NEFA 水平明顯上升（P＜0.05），HDL-C 水平明顯下降（P＜0.05），表明模型組大鼠表現為高血脂；與模型組比較，黃連組血清TG、TC、LDL-C、NEFA 水平下降（P＜0.05），HDL-C 水平升高（P＜0.05），二甲雙胍組血清LDL-C、NEFA 水平下降（P＜0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05），且2個治療組之間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。

2.3各組大鼠胰腺組織中GRP78、CHOP、ATF4蛋白表達水平的比較圖1 ～4 結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠胰腺組織中GRP78、CHOP、ATF4蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）；經黃連和二甲雙胍干預后，大鼠胰腺組織中的GRP78、CHOP、ATF4蛋白表達水平均明顯下降（P<0.01），且2 個治療組之間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠治療后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平的比較Table 2 Comparison of serum TG，TC，HDL-C，LDL-C and NEFA in various groups after treatment（±s，mmol·L-1）

表2 各組大鼠治療后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平的比較Table 2 Comparison of serum TG，TC，HDL-C，LDL-C and NEFA in various groups after treatment（±s，mmol·L-1）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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圖1 各組大鼠胰腺GRP78的表達分布（免疫組織化學法，×200）Figure 1 Comparison of distribution of GRP78 expression in pancreas of rats from various groups（by immunohistochemical method，×200）

圖2 各組大鼠胰腺CHOP的表達分布（免疫組織化學法，×200）Figure 2 Comparison of distribution of CHOP expression in pancreas of rats from various groups（by immunohistochemical method，×200）

圖3 各組大鼠胰腺ATF4的表達分布（免疫組織化學法，×200）Figure 3 Comparison of distribution of NEFA expression in pancreas of rats from various groups（by immunohistochemical method，×200）

圖4 各組大鼠胰腺GRP78、CHOP、ATF4蛋白表達水平比較Figure 4 Comparison of expression levels of GRP78，CHOP，ATF4 proteins in pancreas of rats from various groups

3 討論

在現今許多2型糖尿病患者中，多數都處于超重或肥胖狀態，經常可見高血脂與高血糖并存[16]。這些患者體內長期存在脂質穩態失衡（以TG、LDL-C升高和HDL-C降低為特征）[17]，會加快動脈粥樣硬化的形成，顯著增加糖尿病相關的心、腦血管風險。本研究采用的高糖高脂飲食合STZ注射誘導的2型糖尿病大鼠模型[18]，模擬了糖脂代謝紊亂的環境，能有效地構建與人發病時相同的模型，利于觀察與干預。祖國醫學將2型糖尿病納入“消渴”范疇，中藥黃連在消渴中的運用歷史悠久，歷代醫家皆認為黃連是治療消渴之良藥，單用有效。《名醫別錄》記載黃連“止消渴”，《肘后備急方》用一味黃連蜜丸治消渴尿多，《千金要方》《普濟方》《外臺秘要》等均有關于黃連治療消渴的記載。現代醫家中，仝小林[19]、閆鏞[20]等均有使用黃連治療糖尿病的經驗。根據最新藥理研究，中藥黃連能有效改善肝臟脂毒性[21]，但對胰腺脂毒性的研究尚未明確。因此，本研究使用中藥黃連進行干預，探討黃連對2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性的作用。

眾所周知，β細胞功能障礙是2型糖尿病發病機制之一，而糖脂毒性能加重β細胞功能障礙。加拿大1項為期6年的隨訪研究中[22]顯示，血清NEFA水平與胰島β 細胞功能之間存在負相關性，且NEFA 的血清濃度是預測β細胞功能降低的有力指標。同時，許多體外研究也證明，高脂狀態不僅減少機體循環中NEFA的清除率，同時還釋放更多的NEFA 進入循環中[23]，而高糖狀態也會刺激β 細胞內脂解，促使NEFA 直接在胰腺中生成并蓄積，對胰島β細胞產生脂毒性作用，加重胰島β細胞功能障礙[24]。本研究通過構建以高糖高脂飲食誘導的2 型糖尿病大鼠模型，結果發現模型組的血清FBG、TG、TC、LDL-C 和NEFA 水平顯著高于正常組，HDL-C 水平低于正常組，而二甲雙胍組血清中FBG、TG、TC、LDL-C 和NEFA 水平較模型組明顯下降，HDL-C 水平較模型組升高，以上結果表明經高糖高脂飲食誘導的2型糖尿病大鼠存在血糖和血脂代謝紊亂，且模型組NEFA水平較正常組上升，也證實了NEFA 引起的脂毒性對2型糖尿病發病機制的影響。而應用中藥黃連灌胃后，糖尿病大鼠血清FBG、TG、TC、LDL-C和NEFA水平顯著下降，HDL-C 水平顯著升高，這提示黃連能夠有效地改善2型糖尿病大鼠血糖及血脂水平，并降低循環中NEFA水平，減輕脂毒性的作用。

目前，脂毒性作用影響2型糖尿病加劇發生發展的機制較為復雜，主要與炎癥反應[25]、線粒體功能障礙[26]、內質網應激[25]和氧化應激[27]相關。越來越多的證據表明，內質網應激在2型糖尿病的發病機制中占據重要位置，并與糖脂毒性有關[28]。內質網在脂質生物合成以及分泌蛋白的合成和折疊中起著核心作用。正常生理狀態下的胰島β細胞通過信號轉導促使內質網折疊合成胰島素原，但在糖脂毒性的激發下，內質網腔中容易積累未折疊或者錯誤折疊的蛋白質，這種未折疊的蛋白反應（UPR）即是內質網應激中的一種表現。UPR有3條經典信號轉導通路，研究較多的是蛋白激酶RNA樣內質網激酶（PERK）通路。GRP78是內質網中的分子伴侶，是內質網應激激活的標志物[29]。當內質網出現應激反應時，PERK蛋白磷酸化，介導轉錄因子ATF4 翻譯增加，當ATF4 進入細胞核內，激活下游相關因子，促使CHOP蛋白的表達[30]，進而導致細胞走向凋亡進程。本研究結果顯示，模型組大鼠胰腺中GRP78、CHOP、ATF4 蛋白的表達水平較正常組顯著上升，這提示2型糖尿病大鼠內質網應激狀態已被激活；而經黃連灌胃后的大鼠胰腺GRP78、CHOP、ATF4 蛋白的表達水平較模型組均明顯下降，表明黃連組可改善內質網應激狀態。因此，推測中藥黃連對胰腺脂毒性的調控作用可能通過改善內質網應激機制減少NEFA在胰腺細胞中的堆積來實現。

綜上所述，應用中藥黃連進行干預后可有效改善高糖高脂飲食誘導的2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂，減輕胰腺脂毒性程度，且其作用機制可能與減輕內質網應激，進一步減少胰島細胞走向凋亡有關。本研究的意義在于初步探討了中藥黃連對高糖高脂飲食誘導的2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性的調控作用及內質網應激相關蛋白表達的影響，這為黃連的臨床應用提供良好的實驗證據。但本研究仍存在一定的不足，今后有待深入分析內質網應激凋亡途徑中的ASK1/JNK 及Caspase-12的激活途徑、就中藥黃連中具體哪一有效部分對血脂有切實改善作用進行有效驗證、就中藥黃連的有效成分如何進入細胞影響內質網應激通路進行研究，等等。