腎氣丸對膝骨性關節炎模型大鼠炎癥因子和軟骨基質的影響

李梓灝， 黃剛， 嚴偉健， 胡贏， 謝家豪

（1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州 510006；2.南方醫科大學中西醫結合醫院，廣東廣州 510000）

膝骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以膝關節軟骨基質降解、軟骨退變、滑膜無菌性炎癥以及繼發骨贅形成為主要特征的慢性退行性病變[1]，主要表現為膝關節疼痛、腫脹畸形、活動受限，是中老年人群除心腦血管疾病以外致殘的最主要原因[2]。調查顯示，我國中老年人群KOA的發病率為12%～15%，女性高于男性[3]。隨著我國步入老齡化社會，KOA 的發病率和致殘率呈現直線上升的趨勢，不僅影響患者的生活質量，也對家庭和社會造成嚴重的負擔。研究發現，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素9（IL-9）、基質金屬蛋白酶3（MMP-3）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、Ⅱ型膠原、雌二醇（E2）在KOA 的發生、發展中起到至關重要的作用[4-7]。中醫學認為KOA 的核心病機是肝腎虧虛。腎氣丸出自《金匱要略》，具有補益肝腎的功效，本團隊臨床應用腎氣丸治療KOA 患者，發現其可降低患者血清炎癥因子水平，改善膝關節功能，緩解膝關節疼痛，增加膝關節活動度，提高生活質量，但其具體機制尚不明確。因此，本研究建立了KOA 大鼠模型，觀察腎氣丸對KOA 大鼠膝關節寬度、膝關節被動活動度、滑膜厚度、壓痛閾值、熱痛閾值和關節軟骨中的TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2 的影響，以期闡明腎氣丸防治KOA 的作用和機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康SD 大鼠40 只，體質量（210±10）g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCXK（粵）2018-0002。本實驗于廣東省中醫院中醫藥科學院動物實驗中心進行，飼養環境：溫度20 ～25 ℃，濕度40%～60%，光照周期12 h/12 h。

1.2試劑與儀器木瓜蛋白酶（上海源葉生物科技有效公司）；TNF-α 酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國GeneTex 公司）；IL-1β、IL-9 ELISA試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司）；MMP-3、MMP-9 ELISA 試劑盒（美國ScienCell 研究實驗室）；Ⅱ型膠原ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；E2 ELISA 試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司）。爪觸覺測試儀（意大利Ugo Basile 公司）；YLS-3E 型電子壓痛儀（上海軟隆科技發展有限公司）；BW-Plantar390 足底熱測痛儀（上海軟隆科技發展有限公司）；Multiskan Sky 全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；關節測量尺、游標尺（上海益聯醫學儀器發展有限公司）；ESJ30-5A/B 電子天平（沈陽神宇龍騰天平有限公司）。

1. 3腎氣丸組成及制備腎氣丸由熟地黃15 g、山藥30 g、山茱萸15 g、澤瀉10 g、茯苓10 g、牡丹皮10 g、桂枝10 g、熟附子10 g組成。上述中藥飲片由廣州中醫藥大學第二附屬醫院中藥房提供，加4 倍量的水分別煎煮2 次，濾渣取液，2 次藥液混合后濃縮至含生藥0.23 g·mL-1，于4 ℃冰箱保存備用。

1.4動物分組、造模和給藥40只大鼠適應性喂養1周后，按照隨機數表隨機分為正常組（10只）和造模組（30 只）。造模組大鼠參照Panicker 等[8]的方法建立KOA 模型：將大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，固定于手術臺上，雙膝關節腔內注射40 g/L木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，每2 d 1 次，共注射2 周。正常組大鼠僅對膝關節腔注射生理鹽水。造模期間均自由飲食和飲水。2周后，進行膝關節X線片檢查，若X 線片可見膝關節脛骨平臺骨面欠光滑、不平整，且關節間隙狹窄，則提示造模成功。結果顯示造模組36 只大鼠造模成功。隨后將造模成功的大鼠隨機分為模型組（9 只）、中藥組（9只）、西藥組（9只）。參照劑量-體表面積換算方法，中藥組給予腎氣丸11.55 g·kg-1·d-1灌胃，分2 次進行，西藥組給予氨基葡萄糖生理鹽水溶液157.5 g·kg-1·d-1灌胃，分2 次進行，正常組和模型組給予等體積（3 mL）的生理鹽水灌胃，灌胃時間為8周。

1.5觀察指標與方法

1.5.1 測量膝關節厚度、被動活動度 末次給藥禁食禁飲12 h 后，用游標尺測量大鼠膝關節寬度，用關節測量尺測量膝關節的最大屈曲角度和最大伸直角度，計算被動關節活動度，被動關節活動度=最大屈曲角度-最大伸直角度。

1.5.2 測量膝關節滑膜厚度 麻醉處死大鼠后，打開膝關節腔取關節滑膜組織，用螺旋測微器測量膝關節滑膜厚度。

1.5.3 測定壓痛閾值、熱痛閾值 將大鼠固定于手術臺上，壓痛儀的扁形頭壓大鼠的患側足背，當大鼠掙扎時即為壓痛閾值。將熱痛儀置于大鼠的足底中央，打開計時器計時，當大鼠掙扎抬腿時所用的時間即為熱痛閾值。

1. 5. 4 檢測關節液中TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2水平 常規消毒膝關節后，用5 mL 注射液抽取1.5 mL 生理鹽水注射進大鼠的膝關節腔，反復活動膝關節20 次，緩慢抽取膝關節液，離心后取上清液，于-20 ℃保存備用。按照說明書采用ELISA 法檢測關節液TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2的含量。

1.6統計方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1正常組和造模組大鼠膝關節X線檢查結果比較圖1結果顯示：正常組膝關節關節軟骨厚度正常，關節間隙無狹窄；模型組膝關節間隙明顯變窄，關節軟骨變薄，輕度骨刺，關節面硬化。提示造模成功。

圖1 正常組和KOA造模組大鼠膝關節X線檢查結果比較Figure 1 Comparison of X-ray examination results in the control group and KOA modeling group

2.2各組大鼠膝關節厚度、關節被動活動度、滑膜厚度的比較表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的膝關節厚度、滑膜厚度顯著增加（P<0.05），關節被動活動度顯著減小（P<0.05）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠的膝關節厚度、滑膜厚度均顯著減小（P<0.05），關節被動活動度均顯著增加（P< 0.05），且2 個治療組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠膝關節厚度、關節被動活動度、滑膜厚度的比較Table 1 Comparison of the knee joint space width，passive knee joint range of motion，thickness of synovial membrane in various groups （±s）

表1 各組大鼠膝關節厚度、關節被動活動度、滑膜厚度的比較Table 1 Comparison of the knee joint space width，passive knee joint range of motion，thickness of synovial membrane in various groups （±s）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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2.3各組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值的比較表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的壓痛閾值、熱痛閾值降低（P<0.05）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠的壓痛閾值、熱痛閾值顯著升高（P<0.05），且2 個治療組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.4各組大鼠關節液TNF-α、IL-1β、IL-9含量的比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的關節液TNF-α、IL-1β、IL-9 含量顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠的關節液TNF-α、IL-1β、IL-9含量顯著降低（P<0.05），且2 個治療組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值的比較Table 2 Comparison of the tenderness threshold and thermal pain threshold in various groups （±s）

表2 各組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值的比較Table 2 Comparison of the tenderness threshold and thermal pain threshold in various groups （±s）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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表3 各組大鼠關節液TNF-α、IL-1β、IL-9含量比較Table 3 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β and IL-9 in synovial fluid of various groups （±s，pg·mL-1）

表3 各組大鼠關節液TNF-α、IL-1β、IL-9含量比較Table 3 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β and IL-9 in synovial fluid of various groups （±s，pg·mL-1）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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2.5各組大鼠關節液MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2含量的比較表4 結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的關節液MMP-3、MMP-9含量顯著升高（P< 0.05），Ⅱ型膠原、E2 含量顯著降低（P<0.05）；對模型組比較，中藥組、西藥組大鼠的關節液MMP-3、MMP-9 含量顯著降低（P< 0.05），Ⅱ型膠原、E2 含量顯著升高（P<0.05），且2 個治療組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

膝骨性關節炎（KOA）的主要病理機制是膝關節軟骨的退行性病變，多種因素均通過破壞關節軟骨引起KOA。

炎癥反應、軟骨基質在KOA 中起到重要的作用。KOA 是一種無菌性炎癥，以TNF-α、IL-1β、IL-9 升高為主要表現。TNF-α 可以促進軟骨細胞凋亡，促進Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的降解，破壞軟骨細胞，導致骨贅形成[9]。IL-1β 由軟骨細胞、滑膜細胞、巨噬細胞等分泌生成，可以促進滑膜細胞的增殖和分化，促進軟骨細胞凋亡，促進Ⅱ型膠原蛋白合成和強度下降，促進滑膜細胞和軟骨細胞生成前列腺素E2 和膠原酶，引起滑膜炎癥和軟骨基質降解。研究[10]發現，KOA患者血清或關節液中IL-1β的表達較正常人群顯著升高。IL-9主要由單核細胞分泌，可以引起軟骨細胞死亡和軟骨細胞外基質的降解。研究[11]發現，KOA患者血清中的TNF-α、IL-1β、IL-9水平較正常健康者顯著升高，提示炎癥因子是引起KOA 的重要危險因素。Ⅱ型膠原是軟骨細胞外基質的主要成分，KOA 患者中Ⅱ型膠原降解增多，而合成減少，導致軟骨基質破壞。基質金屬蛋白酶（MMPs）可以促進軟骨基質降解、抑制蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的合成，導致軟骨細胞變性和軟骨缺損。MMP-3 和MMP-9 是MMPs 的主要成員，主要在KOA 患者的滑膜細胞中表達，是引起KOA 的重要原因之一。研究發現，MMP-3 和MMP-9 在KOA 患者軟骨組織中高度表達，而Ⅱ型膠原表達顯著減少[12]，提示MMP-3和MMP-9可引起軟骨細胞外基質的主要成分Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖降解，導致關節軟骨破壞、退變。E2 可以促進成骨細胞增殖分化，促進Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，保護軟骨細胞外基質，對膝關節具有重要的保護作用[13]。

KOA屬于中醫學“痹癥”“骨痹”的范疇。中醫學認為“腎主骨生髓”“肝主筋，為罷極之本”“腎之和，骨也”“膝為筋之府”。KOA的核心基礎為年老體虛、肝腎虧虛[14]。人至中老年，肝腎逐漸虧虛，腎虛不能主骨生髓，骨不得腎陰滋養，引起骨質脆弱而無法生長，肝主筋，肝血虧虛，不能濡養筋脈，不榮則痛。正氣虧虛于內，風寒濕邪侵襲，或瘀血內生，痹阻筋脈，是本病發作的重要誘因。寒濕內侵或瘀血內生而痹阻筋脈，引起關節腫脹畸形，這與TNF-α、IL-1β、IL-9 等引起關節軟骨膝關節骨贅形成，關節腔間隙狹窄的病理表現不謀而合。“肝主筋脈”“腎主骨”，KOA患者肝腎虧虛，無以濡養筋脈，與膝關節液Ⅱ型膠原蛋白、E2水平降低和MMP-3、MMP-9導致軟骨基質破壞、降解不謀而合。因此，TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3 和MMP-9 在一定程度上代表了KOA的致病因子，Ⅱ型膠原蛋白和E2在一定程度上反映了KOA患者的正氣和肝腎功能的強弱。

治病必求于本，因此，KOA 治療主要在于補益肝腎以強筋骨，正所謂“正氣存內，邪不可干”。腎氣丸為補益肝腎的經典名方，方中：附子大辛大熱，溫陽助火，桂枝辛溫，補腎陽，主氣化，通血脈，附子和桂枝合用，寓陽中求陰之意；熟地黃滋陰補腎生精，山藥養脾生精，吳茱萸助陽生精，熟地黃、山藥、吳茱萸重用以滋補肝腎陰精；澤瀉、茯苓淡滲利濕，牡丹皮活血化瘀，合桂枝可溫通血脈。諸藥合用，共奏補益肝腎，兼活血化瘀、淡滲利濕之功。本研究結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的膝關節寬度和滑膜厚度增加，膝關節被動活動度、壓痛閾值、熱痛閾值減小，關節液中的TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9含量升高，Ⅱ型膠原、E2含量降低；與模型組比較，中藥組大鼠的膝關節寬度和滑膜厚度減小，膝關節被動活動度、壓痛閾值、熱痛閾值增加，關節液中的TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9含量降低，Ⅱ型膠原、E2含量升高。表明腎氣丸可以緩解KOA 疼痛，減輕關節內炎癥反應，抑制骨質增生，抑制軟骨基質的降解。

綜上所述，腎氣丸可以通過抑制關節內炎癥反應，抑制關節軟骨基質降解有效減輕KOA 大鼠軟骨損傷，改善膝關節功能。

表4 各組大鼠關節液MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2含量的比較Table 4 Comparison of the contents of MMP-3，MMP-9，typeⅡcollagen，E2 in synovial fluid of various groups（±s）

表4 各組大鼠關節液MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2含量的比較Table 4 Comparison of the contents of MMP-3，MMP-9，typeⅡcollagen，E2 in synovial fluid of various groups（±s）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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